姜黃素聯合KLF8基因siRNA調控JAK2/STAT3信號通路對乳腺癌細胞生長抑制作用的研究

李 新 ，牛 冰 ，李慶輝 ，張成娟

Krüppel樣轉錄因子8(KLF8)是Krüppel樣轉錄因子(Krüppel like transcription factor，KLFs)家族成員之一，是表達廣泛的一個Krüppel樣轉錄因子，參與細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、細胞外基質形成等多種生物學過程[1]，研究[2-3]顯示，包括乳腺癌在內的多種腫瘤中KLF8呈現出過表達，而抑制KLF8后可降低腫瘤細胞生長，提示抑制乳腺癌中KLF8的表達可能影響其發生發展，但目前研究尚不清楚。

姜黃素(Curcumin)是姜黃的根莖中提取出來的一種酚性色素，具有明顯的抗腫瘤作用，有研究[4]顯示，姜黃素可明顯抑制多種腫瘤的生長及誘導凋亡。抑制KLF8基因表達與姜黃素聯合用于乳腺癌是否產生協同治療作用尚不清楚。因此，該研究通過RNA干擾抑制KLF8基因表達及姜黃素單獨或共同處理乳腺癌細胞，檢測對癌細胞活力和凋亡的影響，并進一步研究對其生物學特性影響的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器小牛血清及RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；姜黃素購自美國Sigma公司；AG490購自美國Biosource公司；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海碧云天公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司；KLF8、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(phosphorylated Janus kinase2，p-JAK2)、磷酸化的信號轉導與轉錄因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)、細胞周期素D1(Cyclin D1)和B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體購自美國Abcam公司；酶標儀及流式細胞儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞及其培養人乳腺癌MCF-7細胞購自中國科學院上海細胞庫；MCF-7細胞為貼壁細胞，細胞在含有小牛血清及雙抗的RPMI1640培養基中， 5% CO2、37 ℃飽和濕度培養箱中傳代培養。實驗選擇生長至對數期的細胞。

1.3細胞轉染MCF-7細胞進行常規消化后收集細胞，接種細胞于6孔板，轉染前1 d更換培養液(含有血清，不含抗生素)，待細胞達70%～90%的生長密度時通過脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒將合成的干擾KLF8表達的siRNA(KLF8-siRNA)轉染細胞，同時轉染無干擾作用的siRNA作為陰性對照組，并設置只加入脂質體的為空白對照組，轉染過程嚴格參照試劑盒說明，收集轉染48 h的細胞用于實驗研究。

1.4轉染KLF8-siRNA的MCF-7細胞KLF8的表達通過Western blot檢測轉染KLF8-siRNA的MCF-7細胞KLF8的表達。簡要步驟如下：PBS洗滌轉染48 h的細胞，離心后棄掉上清，加入全細胞蛋白裂解液于冰上反應30 min，離心收集上清液，上清液即為細胞總蛋白。BCA試劑盒對蛋白進行定量，蛋白經100 ℃變性，取等量變性蛋白進行SDS-PAGE分離，電泳結束后切下含有目的蛋白的膠通過電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉轉好的PVDF膜2 h，封閉后置入適當比例的KLF8和GAPDH一抗溶液中，4 ℃緩慢搖動過夜，洗膜，加入二抗，室溫反應2 h，ECL發光后暗室中將X光片曝光，沖洗X光片，拍照掃描，成像分析軟件分析KLF8的相對表達量。

1.5CCK-8法檢測姜黃素聯合KLF8基因siRNA對MCF-7細胞活力的影響以每孔100 μl(約1×104個細胞)接種生長至對數期的MCF-7細胞于96孔板，用于調零組細胞的僅僅加入細胞培養液，細胞長滿50%～80%孔底時參照上述方法進行轉染，并隨機分為陰性對照組(轉染無干擾作用的siRNA)、KLF8-siRNA(轉染合成的干擾KLF8表達的siRNA)、姜黃素組(40 μmol/L姜黃素處理細胞)和KLF8-siRNA+姜黃素組(在轉染KLF8-siRNA的基礎上加入姜黃素)，每組設置5個平行孔，培養48 h后，加入10 μl CCK-8試劑至每孔中，利用調零組調零，酶標儀測定吸光度值(optical density，OD)，以OD值反映細胞活力，可以間接反映出細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.6流式細胞儀檢測姜黃素聯合KLF8基因siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響分組及處理方法同1.5，PBS洗滌各組細胞，Binding緩沖液重懸細胞，利用Annexin V-FITC和PI熒光染色，室溫避光反應15 min，流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.7姜黃素聯合KLF8基因siRNA抑制JAK2/STAT3信號通路對乳腺癌細胞活力及凋亡的影響AG490作為JAK2/STAT3信號通路抑制劑，加入濃度為20 μmol/L，通過CCK-8法及流式細胞儀檢測用KLF8-siRNA+姜黃素+AG490處理細胞相對于KLF8-siRNA+姜黃素處理的細胞活力及凋亡率情況，Western blot檢測p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達，方法同1.4。

2 結果

2.1KLF8-siRNA轉染MCF-7細胞后KLF8的表達KLF8-siRNA轉染MCF-7細胞后KLF8的表達結果見圖1。與空白對照組(0.311±0.035)比較，KLF8-siRNA組(0.102±0.010)KLF8的表達顯著降低(P<0.05)，而陰性對照組(0.302±0.032)和空白對照組KLF8的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 KLF8-siRNA轉染MCF-7細胞后KLF8的表達

2.2姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞活力的影響CCK-8檢測結果顯示：KLF8-siRNA組(0.562±0.048)和姜黃素組(0.626±0.052)的細胞活力均顯著低于陰性對照組(0.873±0.074)(P<0.05)，高于KLF8-siRNA+姜黃素組(0.385±0.041)(P<0.05)。

2.3姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示：KLF8-siRNA組(12.12±1.02)%和姜黃素組(10.77±0.96)%的細胞凋亡率均顯著高于陰性對照組(1.56±0.16)%(P<0.05)，低于KLF8-siRNA+姜黃素組(18.79±1.35)%(P<0.05)。見圖2。

2.4姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1和Bcl-2表達的影響Western blot檢測結果顯示：KLF8-siRNA組和姜黃素組Cyclin D1、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達均顯著低于陰性對照組(KLF8-siRNA組：P<0.05；姜黃素組：P<0.05)，高于KLF8-siRNA+姜黃素組(KLF8-siRNA組：P<0.05；姜黃素組P<0.05)。四組間JAK2和STAT3的蛋白表達差異無統計學意義。見表1、圖3。

2.5姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號對MCF-7細胞活力及凋亡的影響姜黃素、KLF8-siRNA及JAK2/STAT3信號抑制劑AG490共同處理細胞后，細胞OD值及凋亡率檢測結果顯示：與KLF8-siRNA+姜黃素組[(0.422±0.043)、(16.68±1.21)%]比較，KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組OD值(0.301±0.032)顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高[(21.15±1.54)%](P<0.05)。見圖4。

表1 姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達的影響

與陰性對照組比較：*P<0.05；與KLF8-siRNA+姜黃素組比較：#P<0.05

圖2 姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響

圖3 姜黃素聯合KLF8-siRNA對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達的影響

A：陰性對照組；B：KLF8-siRNA組；C：姜黃素組；D：KLF8-siRNA+姜黃素組

2.6姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1和Bcl-2表達的影響姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號后MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達結果見表2、圖5。與KLF8-siRNA+姜黃素組比較，KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

表2 姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達的影響

與KLF8-siRNA+姜黃素組比較：*P<0.05

圖4 姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號對MCF-7細胞活力及凋亡的影響

圖5 姜黃素聯合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號對MCF-7細胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達的影響

A：KLF8-siRNA+姜黃素組；B：KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組

3 討論

研究[5]顯示，在多種腫瘤中，KLFs家族的多個成員與癌基因相關。KLF8是KLFs家族成員之一，在上皮細胞-間充質轉化(epithelial cell mesenchyme transformation，EMT)、細胞致癌性分化、細胞侵襲和遷移、周期循環等過程中均有重要作用，且在多種腫瘤中過表達，其過表達與疾病不良預后及發生相關[6]。也有研究[7]指出抑制KLF8的表達可降低腫瘤的發生發展，如抑制腎癌細胞KLF8表達可降低癌細胞增殖、侵襲及誘導細胞凋亡。KLF8在乳腺癌中的研究相對較少，研究[8]顯示，KLF8在乳腺癌中表達上調，可通過活化基質金屬蛋白9促進乳腺癌的侵襲及轉移。本研究旨在抑制KLF8對乳腺癌增殖凋亡的影響。我國中藥資源豐富，中藥提取物在腫瘤治療的研究受到廣泛關注，姜黃素是姜黃的根莖中提取出來的一種酚性色素，目前在腫瘤中的作用有大量研究，研究[9]顯示，姜黃素可降低乳腺癌的增殖、侵襲、遷移，阻滯細胞周期和誘導細胞的凋亡，但聯合使用姜黃素和KLF8的siRNA是否能更有效地治療乳腺癌還未清楚。

鑒于有研究[2]已證實乳腺癌中KLF8存在高表達，本研究檢測抑制KLF8表達對乳腺癌細胞的影響。由于RNA干擾技術能在基因的轉錄和翻譯水平及染色質水平調節基因的表達，且表現出很強的序列特異性、有效性，在多種腫瘤中研究基因功能時被應用[10]，因此本研究也選用RNA干擾技術抑制乳腺癌中KLF8的表達。將KLF8的siRNA和姜黃素共同處理乳腺癌細胞，結果顯示KLF8-siRNA和姜黃素均能明顯抑制乳腺癌細胞活力和誘導細胞凋亡，這提示KLF8基因和姜黃素能協同用于乳腺癌的防治。信號轉導與轉錄因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是STATs家族的一員，與細胞增殖、凋亡等生物學特性密切相關，在多種腫瘤中出現異常活化，STAT3的異常活化可引起細胞異常增殖分化，且凋亡受到抑制，目前已被確認為癌基因，STAT3引起癌變的機制主要是通過激活CyclinD1、Bcl-2、Survivin等靶基因的一些產物表達實現[11]。CyclinD1是一個細胞周期核因子，可促進細胞的增殖[12]。Bcl-2是Bcl-2家族成員之一，抑制其表達可誘導細胞的凋亡[13]。JAK2處在STAT3上游，JAK2激酶抑制劑AG490可抑制JAK2/STAT3信號通路，從而使細胞增殖受到抑制，AG490可抑制包括乳腺癌在內的多種腫瘤的發生發展[14]。本研究顯示，姜黃素和KLF8的siRNA均能下調p-JAK2和p-STAT3及靶基因CyclinD1和Bcl-2表達，兩者聯合下調更明顯，抑制JAK2/STAT3信號通路后，相對于聯合使用姜黃素和KLF8的siRNA對細胞的抑制作用和凋亡促進作用更明顯。

綜上所述，下調KLF8基因表達和姜黃素均能通過抑制JAK2/STAT3信號通路降低乳腺癌細胞活力，誘導細胞凋亡，兩者聯合對細胞活力及凋亡的影響作用更強。該研究可能為乳腺癌的治療提供了新的途徑，值得進一步深入探討。