兩種移植管下D5、D6囊胚行凍融移植后妊娠結局的比較

王 喆，鄒微微，章志國，紀冬梅，曹云霞

在輔助生殖過程中，影響妊娠結局的一個重要步驟是胚胎移植技術。隨著囊胚培養以及囊胚玻璃化凍融技術在生殖醫學領域中的廣泛應用，目前新鮮周期移植取消率增加，全胚胎冷凍后的凍融胚胎移植比例明顯增長[1]。已有研究[2]表明，全胚胎冷凍可以使卵巢過度刺激綜合征高風險、內膜異常、孕激素過高及患有全身性疾病等不適合新鮮移植的患者將胚胎冷凍以后再移植。有研究[3]表明凍融胚胎移植后的臨床妊娠結局相比于新鮮周期移植的妊娠結局更好。患者自身條件、胚胎發育天數與質量及移植技術等多方面因素是決定凍融囊胚是否可獲得臨床妊娠的關鍵因素。Kovalevsky et al[4]的研究認為第5日(D5)囊胚凍融移植后臨床妊娠率、種植率和抱嬰率顯著高于第6日(D6)凍融囊胚，但Hiraoka et al[5]研究表明D5和D6囊胚凍融移植的臨床結局并無明顯差異。胚胎移植技術中包含很多影響因素，包括移植管類型、移植管血染程度、胚胎裝載入移植管的方式等均會影響妊娠結局。所以輔助生殖助孕中的凍融囊胚移植需要大樣本統計分析并建立標準化操作流程來最大程度的幫助患者提高臨床妊娠結局。本研究回顧性的分析了行體外受精(invitrofertilisation,IVF)或卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療后首次解凍移植的患者共1 032例，比較Cook移植管與Wallace移植管、D5凍融囊胚與D6凍融囊胚對妊娠結局的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年8月～2017年8月在安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心首次接受凍融囊胚移植助孕治療的不孕癥患者為研究對象。納入標準：① 年齡<40歲；② 首次進行解凍移植的D5或D6囊胚；③ 不孕原因為盆腔輸卵管因素或男方因素；排除標準：① 遺傳性及家族性病史；② 有習慣性流產史、不良妊娠史；③ 子宮生殖道畸形；④ 疤痕子宮(剖宮產、子宮肌瘤挖除史)；⑤ 卵巢功能減退、子宮內膜異位癥。本研究為病例對照研究，獲得安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2囊胚培養患者采用的促排卵方案包括長方案、短方案、拮抗劑方案、微刺激方案等。絨毛膜促性腺激素(hCG)注射后34～36 h取卵，所獲卵母細胞置于受精培養液中，男方手淫法或穿刺法取精，精液采用梯度離心法或上游法處理。取卵后3 h行體外受精或者卵胞漿內單精子顯微注射。授精后4～6 h拆除顆粒細胞觀察是否排出第二極體，再將受精卵移至卵裂期培養液，37 ℃培養箱中培養。授精后16～20 h觀察原核形成情況，挑出多PN受精及受精異常胚胎，其余繼續培養48 h，觀察第3日胚胎，評估卵裂期胚胎質量，后將胚胎移入囊胚期培養液，繼續培養至D5或D6囊胚。采用Gardner囊胚評分法對囊胚進行評分，將D5評分≥3AA、3AB、3BA、3BB或者D6評分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定為優質囊胚。

1.3囊胚的玻璃化冷凍-解凍囊胚冷凍流程：① 采用Hamilton軟件進行激光打孔，打孔時避開囊胚內細胞團；② 打孔后囊液流出約5 min后囊胚皺縮；③ 室溫下，將囊胚移入平衡液中5 min；④ 囊胚轉移至玻璃化冷凍液中不超過60 s；⑤ 將囊胚放至在已標記的冷凍載桿上并迅速浸入液氮中保存。囊胚解凍流程：① 將冷凍載桿浸入解凍液中不超過60 s；② 迅速將胚胎移至稀釋液和洗滌液1、2中各3 min；③ 最后將胚胎轉移至囊胚培養液中，并置于平板培養箱內37℃培養；④ 復蘇2 h后觀察囊胚的存活情況。

1.4囊胚移植本中心凍融周期首次解凍移植優先選擇優質囊胚。

1.4.1移植前子宮內膜準備 囊胚移植的內膜準備分為自然周期和人工周期。采用自然周期的患者通過經陰道超聲監測卵泡大小、內膜厚度和形態，通常于排卵日開始口服地屈孕酮(10 mg、Bid)，排卵后D5解凍移植D5或D6囊胚。采用人工周期的患者自月經第3日起口服戊酸雌二醇，12日后經陰道超聲監測子宮內膜厚度，醫師可根據內膜厚度調整用藥劑量，待內膜厚度≥8 mm時，黃體酮60 mg/d肌注，5 d后解凍D5或D6囊胚并移植。

1.4.2移植管選擇 Cook組采用美國Cook移植管(型號：K-JETS-551910-s)，由導引導管和轉移導管組成：導引導管長17.3 cm，直徑約1.81 mm，白色，頭部成球頸型，頭端預彎有25°傾角，宮頸塞設在離頭端4 cm處，在離頭端5 cm處另設有一個活塞；移植導管長24 cm，后端有金屬支撐管支撐，前端為8 cm長的聚乙烯管，外徑約0.93 mm，內徑約0.47 mm，底部有間隔1 cm的4個刻度。在導引導管進入宮腔困難時，可加用支撐芯輔助導引導管穿越宮頸。Wallace組采用英國Wallace移植管(型號：1816)，長18 cm，由兩部分組成：外導管為聚丙烯管，直徑約2.24 mm，外導管內常規含有內芯，內導管為聚氨酯管，直徑約1.65 mm。

1.4.3凍融囊胚移植方法 在實施胚胎移植前囑患者憋尿，取截石位。行經腹部B超確定子宮位置、宮體與宮頸的角度、宮頸管長度及宮腔深度。插導引導管前去除宮頸粘液，用含囊胚培養液的棉簽清洗宮頸內口。兩組裝載胚胎的方法相同，待移植醫師提示可以裝載胚胎時開始裝載，移植管末端連接1 ml注射器，用囊胚培養液沖洗移植管，先抽吸約1 cm空氣，其次是約2 cm含胚移植液，最后是約1 cm空氣。裝載完畢后將移植管遞給助手輔助醫師進行移植。Cook組移植流程：手術醫師將導引導管由宮頸內口進入宮腔，如果由宮頸口進入宮腔困難，可在導引導管內插入支撐芯輔助穿越宮頸，然后將支撐芯抽出，由助手協助將裝載胚胎的轉移導管插入宮腔，緩慢推注完全后留管40 s，取出轉移導管及導引導管，送培養室檢查有無胚胎殘留。Wallace組移植流程：將外導管由宮頸內口輕插入宮腔，插入外導管成功后，抽出內芯，由助手協助插入裝載有胚胎的內導管，將胚胎緩慢注入宮腔后，留管40 s，將移植內、外管一起抽出，送培養室檢查有無胚胎殘留。

表1 Cook組與Wallace組的一般資料比較

1.5胚胎移植后處理及妊娠結局判斷患者平臥休息40 min后離院，醫生指導下繼續予以黃體支持治療。生化妊娠：移植后14 d測血hCG陽性；臨床妊娠：移植后30 d行陰道B超檢查宮腔內孕囊數目及有無心管搏動。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植囊胚周期數×100%；胚胎種植率=B超下檢測到孕囊數/移植囊胚數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；單卵雙胎率=單卵雙胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。

2 結果

2.1患者基本情況分析共有1 032個周期符合本研究納入標準，Cook組共627個周期，其中D5組472個周期，D6組155個周期；Wallace組共405個周期，其中D5組304個周期，D6組101個周期。各組患者的年齡、體質量指數(BMI)、基礎卵泡刺激素(FSH)值、基礎黃體生成素(LH)值、基礎雌二醇(E2)等一般情況比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，組間有可比性。見表1。

2.2不同移植管對妊娠結局的影響Cook組與Wallace組、Cook-D5組與Wallace-D5組、Cook-D6組與Wallace-D6組各組間的獲卵數、受精數、2PN數、囊胚形成率、移植胚胎數、移植日內膜厚度差異均無統計學意義(P>0.05)，Cook組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均高于Wallace組，差異有統計學意義(P<0.05)，兩者的異位妊娠率與單卵雙胎率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2；在同樣移植D5凍融囊胚的情況下，Cook-D5組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均高于Wallace-D5組，差異有統計學意義(P<0.05)，Cook-D5組(2.24%)的單卵雙胎率雖明顯高于Wallace-D5組(0.49%)，但單卵雙胎率差異無統計學意義(P>0.05)，見表3；在同樣移植D6凍融囊胚的情況下，Cook-D6組與Wallace-D6組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.3D5凍融囊胚和D6凍融囊胚的實驗室及妊娠結局比較無論使用Cook移植管或者Wallace移植管，Cook-D5組、Wallace-D5組的獲卵數、受精數、2PN數、囊胚形成率、生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均分別高于Cook-D6組、Wallace-D6組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5、表6。

表2 Cook組與Wallace組的囊胚形成與妊娠結局比較

表3 Cook-D5組與Wallace-D5組的囊胚形成與妊娠結局比較

表4 Cook-D6組與Wallace-D6組的囊胚形成與妊娠結局比較

3 討論

近年來研究表明凍融移植周期在輔助生殖技術中應用越來越廣泛，可獲得與新鮮移植周期相當甚至更好的妊娠結局。在凍融移植周期中，內膜準備方案、子宮內膜厚度、胚胎發育天數及質量、胚胎移植管的選擇、胚胎裝載技術、是否使用超聲引導、移植難易程度、不同醫師的熟練程度等多種因素均會影響胚胎是否移植成功。關于移植管是否會影響妊娠結局目前尚無定論[6-7]。有研究[8]表明D5新鮮囊胚移植的妊娠率和種植率高于D6新鮮囊胚移植, 但凍融囊胚移植周期中由于冷凍及復蘇的影響，不同發育天數囊胚移植的選擇目前仍存在爭議。因此在凍融囊胚移植周期中，移植管的選擇和囊胚發育天數的選擇是目前臨床上急待需要解決的問題。

表5 Cook-D5組與Cook-D6組的囊胚形成與妊娠結局比較

表6 Wallace-D5組與Wallace-D6組的囊胚形成與妊娠結局比較

3.1胚胎移植管的選擇目前臨床上的胚胎移植管主要分為軟移植管和硬移植管，而已有較多研究證實軟移植管比硬移植管的妊娠結局更優。但是不同軟管間哪種移植管更好，目前的研究大部分為小樣本對新鮮胚胎的研究，且并無統一結論。Cook移植管和Wallace移植管是目前生殖中心最常使用的兩種移植管，而關于哪種移植管更好目前尚無統一意見。Saldeen et al[9]的一項前瞻性研究比較202名患者使用Cook Sydney IVF(K-JETS-7019-SIVF)移植管與198名患者使用Edward-Wallace移植管，發現兩者的臨床妊娠率與活產率差異無統計學意義。Rhodes et al[10]研究表明Cook World移植管相比Edward-Wallace移植管，臨床妊娠率高5%，但兩者差異無統計學意義。

本研究共納入1 032例解凍移植周期，比較兩種軟移植管對妊娠結局的影響。兩組患者在平均年齡、基礎性激素、取卵周期獲卵數、受精數、2PN數、囊胚形成率、移植胚胎評價和內膜厚度等基本參數上具有可比性，分析了移植管這一因素對妊娠結局的影響，結果表明Cook移植管可將首次凍融周期的臨床妊娠率與胚胎種植率提高將近7%，尤其對于移植D5凍融囊胚Cook移植管相比于Wallace移植管的優勢更顯著，臨床妊娠率提高將近8%，可以顯著改善妊娠結局，而移植D6凍融囊胚雖Cook移植管妊娠結局更好，但兩者差異無統計學意義，該結果對臨床有指導意義。Cook移植管獲得了較好的臨床結局可能和以下因素有關：一是為了方便手術醫師更準確快速的將移植管置管入宮腔，Cook移植管在設計時考慮到女性宮體與宮頸的生理彎曲度，將導引導管前端預先保留25°傾角；宮頸塞的刻度設在離頭端4 cm處且前端頭部圓鈍，確保導引導管進入宮頸內口后立即停止，盡可能減少導引導管進入宮腔的深度，避免導引導管對宮腔的損傷。二是移植導管內徑更細，僅為1.4Fr(約0.47 mm),且柔軟，可避免造成宮內出血以及內膜損傷，但同時是否因內徑過細造成單卵雙胎率增加仍需增大樣本量進一步探究；裝載胚胎的液體量有可能影響妊娠結局，在裝載胚胎時管徑越細，所需的含胚液體量越少，雖同樣裝載約2 cm含胚液體，Cook移植導管所用的液體量較Wallace內管少，且Wallace移植管沒有刻度，無法精確把握移植管的空氣與液體量；三是Cook導引導管無內芯，相對于有內芯的Wallace導管更加柔軟，且置管后不用拔出內芯可避免對宮腔產生抽吸作用導致子宮內膜損傷。四是相對于Wallace移植管內管與外管之間空隙較大，Cook導引導管與移植導管之間貼合更為緊密，降低了胚胎滯留于移植管內的概率。而移植D6囊胚Cook移植管相比Wallace移植管優勢不明顯，其原因可能是：D6囊胚較D5囊胚囊胚腔擴張更大且可能已孵出，在凍融過程中對胚胎質量影響更大；Wallace移植管較Cook移植管管徑大，若囊胚已孵出，則在囊胚被裝入移植管的過程中，孵出囊胚在管徑較大的移植管內其形態保持更完好，受到的摩擦力更小，其內細胞團所受的影響也越小。

3.2凍融移植囊胚的選擇已有研究[11]表明囊胚發育天數、凍融囊胚質量以及移植數目顯著影響凍融囊胚的妊娠結局。譚巧 等[12]回顧性的分析了1 539例D5與D6凍融囊胚移植妊娠結局, 結果顯示對于35周歲以下的女性，移植D5或者D6優質囊胚其臨床妊娠結局無統計學差異，而在無優質凍融囊胚移植情況下，移植D5非優質凍融囊胚可獲得較好的妊娠結局。本研究結果顯示，D5凍融囊胚組獲卵數、2PN數、受精數、囊胚形成率、生化妊娠率、臨床妊娠率和胚胎種植率均高于D6凍融囊胚組。可能原因如下：D6囊胚較D5囊胚囊胚腔擴張更大，行玻璃化冷凍操作后可能對囊胚質量影響更大；隨著培養時間的延長，培養環境及培養液的改變可能導致胚胎質量變差；D6囊胚發育較D5囊胚相對遲緩，D5囊胚較D6囊胚DNA損傷可能更少；還有研究[13]顯示胞質內線粒體含量明顯影響胚胎發育潛能，D5囊胚線粒體含量可能高于D6；D6凍融囊胚移植與子宮內膜準備不同步也可能影響妊娠結局。

綜上所述，在移植D5優質凍融囊胚時，優先選擇Cook-K-JETS-551910-S移植管較Wallace-1816移植管進行移植可獲得更好的臨床妊娠率和胚胎種植率；在D5與D6同是優質囊胚的情況下，優先選擇D5囊胚進行移植可獲得更好的臨床妊娠率與胚胎種植率。胚胎移植過程中選擇適合患者的移植管可直接影響手術操作及妊娠結局。應盡量選擇軟質、管徑較細、符合生理構造、順滑和對子宮內膜損傷最小的胚胎移植管，以減少困難移植發生率，減輕患者焦慮情緒，提高臨床妊娠結局。本研究為回顧性數據分析，僅納入了本中心常使用的兩種類型移植管，對于應該選擇何種移植管以期獲得最大的臨床妊娠率，仍需要進行多中心的、納入更多移植管類型的前瞻性研究。