沙棘葉和果實中總黃酮提純工藝研究進(jìn)展

周 欣,衛(wèi)培峰,王麗平,羅文佳,高 峰,歐 莉

(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽712046)

沙棘(Hippop Hae rhamnoides L.)是一種胡頹子科落葉性灌木,主要生長于我國的華北、西南、西北等地區(qū),屬藥食兩用植物。1977年,我國衛(wèi)生部首次將沙棘正式列入《中國藥典》。目前,市面上已經(jīng)出現(xiàn)了一些對人體健康有益的沙棘產(chǎn)品。經(jīng)過學(xué)者多年的研究,發(fā)現(xiàn)沙棘果實具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效；沙棘葉具有增強(qiáng)毛細(xì)血管功能及止血、抗凝的作用,并有解痙、抗白癜風(fēng)、抗腫瘤、麻醉、解熱和利膽的作用。沙棘含有包括維生素類、油和脂肪酸類、黃酮類化合物、帖類和甾體類化合物和少量的糖類,多種蛋白質(zhì)氨基酸以及鐵、鋅、鉀、鈉、鈣、鎂、銅、錳等11種微量元素,營養(yǎng)價值較高[1]。現(xiàn)已證實了黃酮類化合物是沙棘的主要化學(xué)成分,其主要包括槲皮素、異鼠李素、楊梅黃素、山奈酚、柚皮素、表兒茶素、白花飛燕草素、3-O-β-D-葡萄糖-(6-O-對羥基反式香豆酰基)山奈素苷、熊果酸等[2]。與此同時有研究發(fā)現(xiàn),沙棘黃酮具有抗氧化、抗心肌缺血、改善心肌細(xì)胞功能、改善心肌肥大、抗血栓形成、降血糖、抗過敏、抗癌等藥理作用[3]。關(guān)于沙棘黃酮的提取方法也有多種,主要有溶劑提取法、索氏提取法、微波提取法、普通超聲提取法、循環(huán)超聲提取法、微波超聲雙輔助提取法；純化方法有膜過濾法、大孔吸附樹脂法、聚酰胺洗脫法等。本研究主要對沙棘葉和果實中黃酮類化合物的提取純化工藝進(jìn)行綜述,為今后學(xué)者的研究提供理論依據(jù)。

1 沙棘葉、果實中黃酮類的提取工藝

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是根據(jù)有效成分的溶解度,選擇適當(dāng)?shù)娜軇?將其從藥材組織內(nèi)提取出來的一種提取方法。王元等[4]分別用60%、70%、80%、90%的乙醇溶液、水、無水甲醇、丙酮等,于80

℃回流提取2次來計算提取率,通過比較提取率以及毒性大小,發(fā)現(xiàn)無水乙醇是比較合適的提取溶劑,但是無水乙醇成本高,沙棘葉價格低廉,綜合考慮,用水作溶劑提取比較經(jīng)濟(jì)合理,因此,最后選擇水為提取溶劑。通過正交試驗優(yōu)選出最佳的提取條件：提取溫度為80℃,提取時間為2 h,料液比1∶12提取2次。李柰等[5]采用單因素優(yōu)化和響應(yīng)面優(yōu)化法,用熱水堿提取沙棘葉中的黃酮；通過控制單因素(p H值、時間、溫度、質(zhì)量濃度)來確定最佳提取條件,最適合的p H值是10、時間為2 h、溫度為70℃、質(zhì)量濃度33.3 mg/m L；而響應(yīng)面優(yōu)化的熱水堿提取沙棘葉中黃酮的最佳條件是p H=11.4、溫度為75.5℃、質(zhì)量濃度為28.6 mg/m L,在此條件下黃酮的產(chǎn)率為1.23%。此法成本低,并且操作簡單,適合工業(yè)化生產(chǎn)。

袁本香等[6]研究了從沙棘果實中提取黃酮的最佳工藝,采用正交試驗對提取黃酮的提取時間、提取次數(shù)、料液比以及乙醇濃度4種因素進(jìn)行了優(yōu)選；最終根據(jù)黃酮的產(chǎn)率選擇最佳的工藝條件為：提取溫度75℃,料液比控制在1∶8,用60%乙醇連續(xù)回流提取3次,每次1 h。袁媛等[7]將水解后的黃酮苷作為評價沙棘果中黃酮提取工藝的評價指標(biāo),采用高效液相法測定沙棘提取液未水解以及水解樣品中槲皮素、山柰酚、異鼠李素3種苷元的峰,以確定實驗中所提取黃酮苷類化合物的含量；用單因素以及正交試驗結(jié)合的方法來篩選出沙棘果實中黃酮苷的最佳提取工藝條件為：70℃下采用60%的乙醇浸提,固液比1∶15,回流提取(0.5 h×3)。

1.2 微波提取法

微波提取法,運用相似相容原理在電磁場的作用下,將固體或半固體中的有機(jī)物成分與基體進(jìn)行有效的分離,具有波動性、高頻性、熱特性和非熱特性四大特點。楊喜花等[8]采用微波技術(shù)提取沙棘葉中總黃酮,通過單因素試驗和正交試驗來考察微波提取條件對提取沙棘葉總黃酮的影響,最終確定在提取時間為10min、微波功率為400W時,用微波技術(shù)提取沙棘葉得到的黃酮提取率最佳。乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,料液比1∶25。微波提取方法與超聲循環(huán)提取法、索氏提取法相比,從省時的角度考慮,在很大程度上縮短了提取時間,并且增加了提取效率。曹葉霞等[9]以水為介質(zhì),對沙棘葉進(jìn)行微波處理以提取黃酮,通過比較三種單因素(微波功率、時間、料液比)對提取的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：料液比對提取率影響最大,其次是微波功率,提取時間影響最小。其提取效果與常規(guī)水浸提法相比,微波提取效率大大提高。實驗結(jié)果最后驗證了微波水提取黃酮的最佳工藝為：微波功率360 W,提取時間3 min,沙棘葉粉與水的質(zhì)量比為1∶30,提取率為1.21%。J FAN等[10]采用微波萃取技術(shù)從新鮮沙棘葉中提取黃酮類化合物,通過單因素和正交試驗驗證了微波提取的最佳條件：50%乙醇溶液,微波功率550W,輻射時間5min、固液比1∶40；索氏提取法的工藝條件：乙醇溶液(體積比)50%,微波功率550 W,輻射時間5min,固液比1∶40；微波提取與索氏提取法相比,具有節(jié)省時間、溶劑用量少、產(chǎn)量高的優(yōu)勢。

1.3 索氏提取法

索氏提取法是運用溶劑回流和虹吸原理用索氏提取器從固體物質(zhì)中萃取化合物的一種方法,這種方法比較簡單易行。鄭京等[11]運用索氏提取法從沙棘葉中提取黃酮,然而為了避免黃酮在提取時有誤差,先用石油醚將油質(zhì)及色素等雜質(zhì)先行除掉,再用80%的乙醇來加熱提取,在加熱的過程中要求注意避光。通過正交試驗得出索氏提取沙棘葉總黃酮的最佳提取條件：用80%的乙醇,提取p H=9,最佳提取時間為6 h；而且要注意提取黃酮時要用50%的氫氧化鈉來調(diào)節(jié)p H,這樣有利于控制乙醇的濃度。尹建波等[12]通過索氏提取法從沙棘落葉中提取黃酮,并用氯化鋁進(jìn)行含量測定,從黃酮含量來確定最優(yōu)提取條件：p H=9,乙醇的濃度為75%,黃酮的含量為36.993 7mg/g。

1.4 普通超聲提取法

超聲波提取是根據(jù)物質(zhì)中有效成分的溶解度、極性、狀態(tài),合理利用超聲波的振動來進(jìn)行提取。此提取方法具有提取溫度低、提取率高、提取時間短的獨特優(yōu)勢,可替代傳統(tǒng)剪切工藝方法,從而實現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取。焦翔等[13]以水和乙醇為提取溶劑,采用浸提法和超聲波輔助提取法對沙棘葉中黃酮進(jìn)行了提取。通過對比發(fā)現(xiàn),在浸提法中乙醇提取率明顯高于水提取率,并且超聲輔助提取優(yōu)于浸提法。實驗結(jié)果證明：超聲提取1 h相當(dāng)于浸提24 h,這大大節(jié)省了時間與成本。張益娜等[14]通過超聲波提取沙棘葉中的黃酮,以此來研究黃酮的抑菌作用,以60%乙醇為提取溶劑,在40℃條件下,超聲30 min來提取黃酮。

曹紅等[15]采用超聲波輔助提取法提取新疆沙棘果中的總黃酮,采用正交試驗來確認(rèn)超聲波輔助提取法提取沙棘果實中總黃酮的最佳工藝條件為：超聲波功率150 W,超聲波頻率20k Hz,提取溶劑乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶20(g∶m L),溫度為60℃,超聲時間為40 min,提取2次。此工藝在相同的提取條件下,相比傳統(tǒng)的熱回流提取工藝,總黃酮得率提高了0.73%。

1.5 超聲循環(huán)提取法

超聲循環(huán)提取法是一種采用物料循環(huán)、超聲場固定分布、物料在超聲場中順序移動的技術(shù),此技術(shù)優(yōu)于普通的超聲提取技術(shù)。楊喜花等[16]分別用索氏提取法、超聲提取法和超聲循環(huán)提取法三種方法從沙棘葉中提取黃酮,比較了這三種方法對沙棘葉中黃酮的提取率。研究表明：運用超聲循環(huán)提取技術(shù),用75%的乙醇、超聲提取10min得到的沙棘葉中的總黃酮提取率相當(dāng)于索氏提取法提取6h的提取率,相比于普通超聲法有很大的提高。

1.6 其他提取法

勻漿法是指通過在生物組織中加入提取溶劑進(jìn)行組織勻漿或磨漿,以提取活體組織中有效成分的一種提取方法。趙春建等[17]將新鮮的沙棘果和提取溶劑在勻漿提取裝置中混合勻漿,通過機(jī)械作用將物料粉碎,使物料粉碎和有效成分提取同時進(jìn)行,這樣的方法更加簡單、快速。最終確定了最佳的工藝參數(shù)：將含水率為85%的沙棘果,用85%的乙醇,勻漿10 min,控制固液比為1∶5,在此條件下,提取率最高。與傳統(tǒng)的回流提取法相比,勻漿法具有省時、省溶劑的優(yōu)點。

超聲微波雙輔助法是將超聲波和微波提取法的優(yōu)點相結(jié)合的一種新的提取方法。趙芙蓉等[18]采用超聲和微波雙輔助提取技術(shù)對沙棘葉黃酮進(jìn)行了提取,利用響應(yīng)面分析法選出最佳的提取工藝參數(shù)：在超聲條件(超聲時間25 min、超聲溫度為60℃)不變的情況下,乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.1%,固液比1∶17.7 g/m L、微波火力為80%、輻射時間為3.33min,在此條件下沙棘葉黃酮的含量為42.75 mg/g,此法與一些常見的提取方法比較,黃酮的提取率最高。此提取方法成本低廉、設(shè)備簡單、操作簡單。

2 沙棘葉、果實中黃酮的純化工藝

2.1 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂法是以獨特的吸附溶劑為媒介,從中藥水煎液中有選擇地吸附其中的有效成分,除去無效成分的一種提取精制的新工藝。大孔吸附樹脂純化方法設(shè)備簡單、操作方便、節(jié)省能源、成本低,并且產(chǎn)品純度高、不吸潮等。因此,該純化法在中藥有效成分的提取分離過程和生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛,且這種方法在中藥有效成分分離中的應(yīng)用在近幾年取得了良好的效果。王芃等[19]根據(jù)黃酮的結(jié)構(gòu)特點,以其疏水和氫鍵作用的協(xié)同效應(yīng),合成了一系列帶有弱疏水骨架、酰胺功能基的大孔吸附樹脂。結(jié)果表明：含有最恰當(dāng)骨架結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)的EGDMA是比例為15%的E15NC樹脂,而且通過實驗發(fā)現(xiàn)其對沙棘葉黃酮具有最好的吸附選擇性。以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.14%的沙棘葉黃酮粗提物為原料,經(jīng)“吸附-解吸”一步連續(xù)操作,沙棘葉總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)就可增加到42.17%,回收率可達(dá)85.14%。并且大孔吸附樹脂純化操作簡單、成本比較低,對環(huán)境污染也較小。此法可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),可以節(jié)省成本,并帶來更好的效益。李淑珍等[20]選用AB-8型大孔樹脂進(jìn)行吸附純化,用濃度為0.20 mg/m L,p H=6.0沙棘葉黃酮溶液上樣,控制流速為2.0 m L/min；選用70%乙醇進(jìn)行洗脫,用量為4BV,流速為3.0 m L/min。用此方法,10g沙棘葉粉碎物經(jīng)提取可得8.71 g粗制品,純化后得1.29g精制品,總黃酮含量為14.89%,比粗制品黃酮含量大大提高。

2.2 聚酰胺洗脫法

聚酰胺洗脫屬于氫鍵吸附,聚酰胺的洗脫強(qiáng)度與化合物的羥基數(shù)目有一定的相關(guān)性,羥基數(shù)目越多,吸附越牢固,越難洗脫。陳彤彤等[21]創(chuàng)建了一種采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的方法,以沙棘葉經(jīng)提取、水解、除雜后所得的粗提物為原料,將此粗提物與1～5倍量聚酰胺粉末攪拌混合,上樣于20～60倍量層析用聚酰胺組成的層析柱上,先用不少于2倍柱體積(BV)的水洗去極性雜質(zhì),再依次用10%～100%梯度濃度的極性有機(jī)溶劑分別洗脫雜質(zhì)和沙棘葉中黃酮,流速為1～3 BV/h,收集洗脫液,回收溶劑并進(jìn)行濃縮后,得到沙棘黃酮。

2.3 膜過濾法

膜是具有選擇性分離功能的材料,利用膜的選擇性分離實現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過程稱作膜分離。根據(jù)其孔徑的大小,可以分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜,用膜進(jìn)行過濾的裝置簡單、占地少、投資少、運行成本低,并且分離、濃縮效果比較好。劉玉平等[22]建立了一種運用膜分離技術(shù)進(jìn)行沙棘黃酮純化的工藝,在用膜分離前,沙棘果實粗粉先用超臨界CO2萃取其脂溶性成分,除去油脂成分后再加乙醇回流提取,而沙棘葉粗粉經(jīng)加水回流提取后,將得到的沙棘黃酮粗提液先用1500～2000 dalton的膜進(jìn)行過濾,再用200 dalton的膜進(jìn)行過濾,得到的沙棘黃酮濕粉再進(jìn)行負(fù)壓干燥,最終得到沙棘黃酮粉。此方法與傳統(tǒng)的過濾方法相比,是一個物理變化的過程,不需要發(fā)生相的變化和添加助劑。

3 結(jié)語

隨著社會發(fā)展和環(huán)境惡化,以及人們生活節(jié)奏的加快,更多的疾病在日益嚴(yán)重地影響著人們的健康,比免疫力低下、腫瘤、心肌缺血、高脂血癥等疾病對人類的健康造成了嚴(yán)重威脅。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有較高的治療價值[23],如沙棘黃酮在人外周血單個核細(xì)胞中可以刺激產(chǎn)生白細(xì)胞介素以及腫瘤壞死因子,對殺死腫瘤細(xì)胞有關(guān)鍵作用[24]；然而對于黃酮化合物的提取工藝各有優(yōu)劣。本研究探討從沙棘葉和果實中提取黃酮的方法與純化工藝,通過研究發(fā)現(xiàn),黃酮的有機(jī)溶劑提取方法有甲醇提取和乙醇提取,雖然甲醇提取的黃酮得率比乙醇提取高,但是甲醇毒性比較大,因此選用乙醇作為提取溶劑,可降低成本,減少污染；然而有機(jī)溶劑的提取率雖然比較高,但是耗時較長。對不同提取工藝進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)：索氏提取法相比于溶劑提取法,提取溶劑少、設(shè)備簡便、操作簡單、耗時短,適用于實驗室；微波提取法用時少,提取的產(chǎn)量也較高；超聲波提取和超聲波循環(huán)提取操作簡單,用時也比較短,超聲10 min相當(dāng)于索氏提取6 h,提高了效率；另外勻漿法將原料進(jìn)行勻漿,也縮短了提取的時間,減少了提取溶劑的用量；超聲微波雙輔助提取法同時融合了超聲和微波的優(yōu)點,是提取效率最高的一種提取方法,此法設(shè)備簡單,適用于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取較為耗時、耗料,如果在設(shè)備欠缺的情況下,采用勻漿法可以相應(yīng)提高提取率；而從時間方面考慮,微波提取法以及超聲微波雙輔助提取法耗時最短,其次是索氏提取、超聲波提取和超聲波循環(huán)提取,耗時也較短。對于沙棘黃酮產(chǎn)率來說,超聲微波雙輔助提取法是提取產(chǎn)率最好的提取方法,此法可用于規(guī)模化生產(chǎn)。

關(guān)于沙棘黃酮的純化工藝研究,也已取得一定進(jìn)展。大孔吸附樹脂法是目前用于黃酮純化最多的一項純化方法,此法操作簡單、成本低、對環(huán)境污染小,為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了更好的效益。不過,關(guān)于膜過濾法和聚酰胺洗脫法用于沙棘黃酮的純化,研究資料比較欠缺,膜過濾法是一種物理變化的過程,對環(huán)境的污染較小；聚酰胺洗脫法則是利用氫鍵吸附作用,其效果取決于羥基的數(shù)目。因此,對于沙棘黃酮的提取純化方法,應(yīng)該根據(jù)現(xiàn)有的條件,選擇適當(dāng)?shù)奶峒兎椒?以達(dá)到最好的提純效果。