水體中根腫菌孢子實時熒光定量PCR檢測體系的建立

趙瑋琦，何朋杰，吳毅歆 ,2*，何月秋

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國家工程研究中心，云南 昆明 650201；3.微生物菌種篩選與應(yīng)用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650217)

【研究意義】根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的一種十字花科植物(Cruciferae)土傳病害，在世界范圍內(nèi)傳播[1-3]。1737年，該病首次在歐洲南部、地中海兩岸發(fā)現(xiàn)，此病在溫帶地區(qū)發(fā)生率最高[4]。田間受到此病污染，土壤和水源將會長期帶菌，作物產(chǎn)量下降，發(fā)病嚴(yán)重時甚至絕收，使該地區(qū)不能再種植十字花科植物[5]。該病菌寄主范圍廣，并可通過栽培和野生十字花科植物的種子、病苗、及土壤、流水、堆肥、禽畜及其帶菌糞便等多途徑傳播。現(xiàn)代化種苗業(yè)的主要育苗形式靠溫室大棚的漂浮育苗，許多育苗基地出售帶有漂浮盤的秧苗，隨后收回苗盤，沒有徹底消毒或者將粘附盤外的土壤帶入育苗池水中，致使根腫菌帶到池水中，加速病害傳播[6]。專性寄生的根腫病菌不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，很難用傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定和檢測。因此，建立簡便、快速和準(zhǔn)確的檢測技術(shù)尤為重要，對控制該病傳播，保障十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】PCR技術(shù)使得根腫菌檢測研究有了跨越式的發(fā)展[7]。Faggian R等制備特異性的PCR引物用于檢測土壤和水中的根腫菌[8]。Ito S等最早應(yīng)用PCR檢測到土壤中根腫病病原菌[9]。Wallen Hammar用巢式PCR 技術(shù)擴(kuò)增rDNA，檢測自然受根腫菌侵染的土壤，其中病情指數(shù)高于21 %的接種土樣能檢出陽性[10]。接種3 d后，未表現(xiàn)出癥狀的十字花科作物根部組織用同樣的方法也能夠檢測出有根腫菌[11]。李妍等建立實時熒光定量PCR體系，定量檢測土壤樣品來自人工接種及田間[12]。楊佩文等將PCR技術(shù)應(yīng)用于根腫病病原菌的檢測[13]。尹全等建立了土壤根腫病菌休眠孢子PCR快速檢測方法[14]。實時熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的核酸定量技術(shù)，同時具備了DNA 雜交技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，彌補(bǔ)了普通PCR 的不足。宋瓊等應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了40份土樣的根腫病菌休眠孢子量[15]。李淼等用熒光定量PCR技術(shù)對云南省十字花科蔬菜基地22份土壤樣品進(jìn)行了檢測，可快速檢測和定量土壤中病原菌[16]。【本研究切入點】采用近年已發(fā)表的根腫菌根據(jù)ITS基因序列設(shè)計1對特異性引物，結(jié)合水體提取基因組技術(shù)，建立了水體中根腫菌SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測體系，為快速檢測水體中根腫菌提供一種新的方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】針對苗床水、灌溉水?dāng)y帶根腫菌傳播的突出問題，在大規(guī)模育苗時，準(zhǔn)確和定量檢測水體中根腫菌，為病害預(yù)防和有效控制，培育健康種苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 從昆明、安寧等地區(qū)采集白菜根腫組織。大腸桿菌(E.coil)菌株TG-1、T1-1及DH5α、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)E3、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Y2、柑橘黃龍病病原菌(Candidatusliberibacter)、假單胞菌(Pseudomonas)E12、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)L9、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)C6、熒光假單胞菌(P.fluorescent)df則均由本實驗室保存。

1.1.2 重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒為pMD18-T載體連接1091 bp根腫菌ITS基因片段，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張立群教授提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、250ⅡDNA Marker、PMD-18T、PUC-19和SYBR?Green premix DimerEraserTM購自TaKaRa公司。Plasmid Kit試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、DNA Water Kit試劑盒均購自O(shè)MEGA公司。CTAB、氯仿、異戊醇、乙醇、異丙醇購自Sigma公司。PCR擴(kuò)增儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電泳儀(DYY6C)購自北京六一廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)(Biotop，220V)購自上海山富科學(xué)儀器有限公司。核酸蛋白分析儀購自Beckman公司。StepOnePlus實時熒光定量 PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.1.4 RT-PCR引物 根據(jù)近年研究發(fā)表的一對引物DC1R/DC1F[11]和根腫菌ITS基因序列設(shè)計的一對引物。引物序列為上游引物DC1F：5’-CGGCTAGGATGGTTCGAAAA-3’，下游引物DC1R：5’-CGGCTAGGATGGTTCGAAAA-3’，預(yù)期擴(kuò)增基因片段大小為90 bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 采用改良CTAB法1從組織中提取DNA：選取含有病原菌的植物組織部位，液氮研磨，SDS(20 %)150 μl搖床37 ℃ 10 min，加入500 μl的氯仿∶異戊醇(24∶1)，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入新管中，異丙醇沉淀，酒精漂洗，37 ℃干燥，ddH2O或TE緩沖液溶解，-20 ℃保存。

采用改良CTAB法2從菌液中提取DNA：培養(yǎng)菌株至飽和態(tài)，取1.5 mL 菌液10 000 r/min離心富集，570 μl TE緩沖液懸浮沉淀，加入30 μl 10 %SDS和3 μl 20 mg/mL蛋白酶K溶液后37 ℃孵育1 h，加入100 μl 5 M NaCl溶液混勻，加入80 μl CTAB/NaCl溶液65 ℃水浴10 min，上清液移入新管0.6倍體積異丙醇沉淀后用酒精洗滌，烘干，溶于ddH2O或TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 將保存的菌株劃線培養(yǎng)在加有Amp的LB培養(yǎng)基上，挑取單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp濃度為100 μg/mL)中，置于搖床上37 ℃培養(yǎng)24 h。按質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒使用Q-PstⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為20 μl，其中10×Buffer 2 μl，Q-PstⅠ酶1 μl，質(zhì)粒5 μl，ddH2O12 μl，37 ℃反應(yīng)6 h。酶切后的線性質(zhì)粒在1.0 %瓊脂糖凝膠中100V電泳1 h，切下單一條帶膠回收純化。純化后的質(zhì)粒使用核酸蛋白分析儀測定質(zhì)粒的DNA濃度，計算其拷貝數(shù)后，分裝于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

計算公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)=(N×6.02×1023)/(MW×109)，N為質(zhì)粒濃度，單位為ng/μl；MW(重組質(zhì)粒分子量)=3981 (線性質(zhì)粒長度)×649(一對堿基對的平均分子質(zhì)量)。

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化 根據(jù)SYBR?Green premix DimerEraserTM的操作說明書配制RT-PCR反應(yīng)體系，分別對引物濃度 (0.2～1 pmoL)，退火延伸溫度(55～65 ℃)等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過比較不同條件下，不同標(biāo)樣的Ct值落點的范圍、平臺期的熒光強(qiáng)度、擴(kuò)增曲線的形狀等來判定不同條件下反應(yīng)的優(yōu)劣。

(2)若實際安全支出較計劃安全成本超支，且安全保障實際水平小于計劃水平，說明當(dāng)前項目安全管理出現(xiàn)了嚴(yán)重的問題，項目經(jīng)理部應(yīng)仔細(xì)分析具體是哪些安全投入超支，并結(jié)合專家對當(dāng)月項目安全評價情況分析到底是哪些管理環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問題，找出解決辦法，保證項目施工安全。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品母液，測量濃度后稀釋為109拷貝/μl，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1×101～1×107拷貝/μl這7個梯度稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作反應(yīng)模板，用優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，同時以ddH2O為空白對照，以pMD18-T空質(zhì)粒為陰性對照，每個標(biāo)準(zhǔn)品、空白及陰性對照均做3個重復(fù)。以起始模板拷貝數(shù)對數(shù)為X軸，△Rn值為Y軸做回歸曲線，建立根腫菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 RT-PCR檢測方法特異性分析 使用腸桿菌TG-1、大腸桿菌T1-1、大腸桿菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢桿菌XF-1、解淀粉芽孢桿菌Y2、柑橘黃龍病病原菌、假單胞菌E12、成團(tuán)泛菌L9、陰溝腸桿菌C6、熒光假單胞菌df等細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行RT-PCR特異性檢測，同時陰性對照為pMD18-T和pUC-19空質(zhì)粒，空白對照為ddH2O，每個處理3個重復(fù)。

1.2.6 RT-PCR檢測方法重復(fù)性分析 測定7個濃度梯度標(biāo)樣的Ct值，重復(fù)6次，通過計算各組Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)來評價RT-PCR方法的重復(fù)性。

1.2.7 根腫菌孢子懸浮液制備 將白菜發(fā)病根部洗凈，-20 ℃冰箱保存。使用時取100 g發(fā)病根組織與200 mL無菌水打碎至勻漿狀，用4層紗布過濾的濾液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，2500 r/min離心20 min，棄上清后加入50 mL無菌水重新懸浮，此步驟重復(fù)3次；棄上清，加入50 %蔗糖溶液5 mL懸浮，2500 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，加入45 mL無菌水混勻；2500 r/min離心20 min，沉淀溶于5 mL無菌水中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ醚蛴嫈?shù)板觀察檢測孢子懸浮液濃度，并稀釋成101～107個/mL等7個梯度的樣品，每個濃度100 mL備用。

1.2.8 水樣品RT-PCR檢測 按照水體DNA試劑盒Water DNA Kit(Omega公司)操作步驟稍作改進(jìn)提取DNA，溶于100 μl Ellution Buffer。用0.22 μM水系濾膜、布氏漏斗和抽濾泵抽濾樣品水體富集根腫菌孢子。記錄抽濾的水體體積，將濾膜剪碎分裝入4個2 mL離心管中，用抽濾水體的體積，計算樣品中孢子的濃度。同時設(shè)置ddH2O代替模板DNA作為陰性對照，每個樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒純化

提取質(zhì)粒，酶切、純化后，得到的線性質(zhì)粒，經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析，在3784 bp處有條帶(圖1)，片段在根腫菌基因組中為單拷貝，與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供大小相一致。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，重組質(zhì)粒的濃度為45 ng/μl，經(jīng)計算純化后的線性質(zhì)粒約為4.2×1010拷貝/μl，稀釋至1×109拷貝/μl作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

2.2 RT-PCR反應(yīng)體系的建立

通過Steponeplus software系統(tǒng)軟件分析RT-PCR結(jié)果，得出最佳反應(yīng)條件是20 μl反應(yīng)體系，其中SYBR?Green premix DimerEraserTM10 μl，DC1R和DC1F各0.4 μl，ddH2O 5.2 μl，模板4 μl。反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。其中延伸最后10 s為熒光信號接收時段。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析后繼續(xù)進(jìn)行建立熔解曲線的反應(yīng)：90 ℃變性1 min；之后降溫至60 ℃形成雙鏈結(jié)構(gòu)，每0.3 ℃為一個循環(huán)，每個循環(huán)30 s，期間持續(xù)采集熒光信號，在溫度范圍 60～90 ℃內(nèi)檢測熒光強(qiáng)度的變化，繪制熒光強(qiáng)度變化的曲線，該曲線的導(dǎo)數(shù)曲線圖譜即為溶解曲線，其峰值為某一DNA片段的Tm值，單一峰對應(yīng)特定的DNA片段。

M：250Ⅱ Marker；1：陰性對照；2：線性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒M：250Ⅱ Marker；1：Negative control；2：Standard plasmid圖1 酶切后的線性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Fig.1 Linear standard plasmid after restriction enzyme digestion

圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RT-PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of RT-PCR reaction of standard plasmid

2.3 RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RT-PCR反應(yīng)的熔解曲線Fig.3 The melting curve of RT-PCR reaction of standard plasmid

1：1×107copies/μl；2：1×106copies/μl；3：1×105copies/μl；4：1×104copies/μl；5：1×103copies/μl；6：1×102copies/μl；7：1×101copies/μl；8：陰性對照圖4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RT-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線Fig.4 The amplification curve of RT-PCR reaction of standard plasmid

根據(jù)所得的熔解曲線(圖3)可知，在熔解溫度Tm=84.98 ℃出現(xiàn)單一峰形，未出現(xiàn)其他峰值，熔解溫度均一，并且峰的形狀也較良好，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性良好，無非特異性擴(kuò)增，故以該對引物基礎(chǔ)進(jìn)行定量PCR是可靠的。

擴(kuò)增曲線(圖4)呈典型的S型，曲線平滑、傾斜度較大，各Ct值之間的間隔比較均勻，平臺期熒光強(qiáng)度無反應(yīng)抑制現(xiàn)象，且很強(qiáng)，可以看出擴(kuò)增效率較高且穩(wěn)定，進(jìn)一步確定前面所述的RT-PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系是合理的。

曲線1：1×104copies/μl標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；曲線2：pMD-18vector；曲線3：pUC-19vector；曲線4：ddH2O；曲線6：大腸桿菌TG-1；曲線6：大腸桿菌T1-1；曲線7：大腸桿菌DH5α；曲線8：肺炎克雷伯菌E3；曲線9：枯草芽孢桿菌XF-1；曲線10：解淀粉芽孢桿菌Y2；曲線11：黃龍病病原；曲線12：假單胞菌E12；曲線13：成團(tuán)泛菌L9；曲線14：陰溝腸桿菌C6；曲線15：熒光假單胞菌df圖5 RT-PCR方法特異性檢測結(jié)果Fig.5 The specificity evaluation of RT-PCR reaction

表1 RT-PCR檢測方法的重復(fù)性實驗Table 1 The repeatability experiment of RT-PCR detection method

表2 7個水體樣品中根腫菌孢子的的定量檢測Table 2 Quantitative detection of resting spores of Plasmodiophora Brassicaein water samples

2.4 RT-PCR檢測方法特異性分析

對大腸桿菌TG-1、大腸桿菌T1-1、大腸桿菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢桿菌XF-1、解淀粉芽孢桿菌Y2、柑橘黃龍病病原菌、假單胞菌E12、成團(tuán)泛菌L9、陰溝腸桿菌C6、熒光假單胞菌df等進(jìn)行檢測，陰性對照為pMD18-T和pUC-19空質(zhì)粒，空白對照為ddH2O。結(jié)果顯示非特異性模板均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其對應(yīng)的擴(kuò)增曲線Ct值與陰性對照重合，可判定為陰性。也均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，因此，該方法及其所使用的引物對根腫菌的檢測是特異的(圖5)。

2.5 RT-PCR方法重復(fù)性分析

用7個不同濃度模板重復(fù)測定6次，得到6組梯度的Ct值，計算每組Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù) (表1 )。結(jié)果表明，變異系數(shù)小于1 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 模擬水體的檢測

用蔗糖梯度離心純化得到的根腫菌孢子懸浮液經(jīng)血球計數(shù)板檢測后濃度為2.5×109cfu/mL，將其稀釋到1×101～1×107cfu/mL進(jìn)行定量檢測，以ddH2O為空白對照(表2)。該基因在根腫菌中為單拷貝，檢測下限至少為100 cfu/mL。

3 討 論

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染引起的病害，任何十字花科植物都能被侵染。病菌休眠孢子通過雨水、灌溉水、昆蟲、地下害蟲及農(nóng)事操作等多途徑傳播，田間一旦受到根腫菌的污染，將長期帶菌，從而影響十字花科作物的持續(xù)生產(chǎn)。帶菌水傳播也是根腫病迅速蔓延的重要因素[6]。因此，建立水體中根腫菌孢子熒光定量PCR檢測體系是非常必要的。對水源進(jìn)行監(jiān)測，能準(zhǔn)確預(yù)測病害的發(fā)生，及時的作出早期診斷[17]。從源頭上控制根腫菌的傳播，這對通過灌溉水處理控制病害，確保規(guī)模化和科學(xué)化育苗有重要意義。

RT-PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的實時定量檢測特定核酸序列的技術(shù)，是核酸探針技術(shù)和熒光共振能量傳遞技術(shù)與PCR技術(shù)的結(jié)合[18]。本試驗采用SYBR Green熒光染料方法對特異性產(chǎn)物的鑒別和定量。此種染料可以在與雙鏈DNA結(jié)合時，比游離狀態(tài)時可發(fā)出強(qiáng)103倍的熒光，擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的量與發(fā)出全部熒光信號增加的量成正比，根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度檢測出反應(yīng)體系中DNA的數(shù)量。但缺點是熒光染料對雙鏈DNA結(jié)合是非特異性的，定量的精確性受到一些假陽性現(xiàn)象的干擾[18-19]。要避免這種影響，可通過設(shè)計特異性更強(qiáng)、不易產(chǎn)生二聚體的引物，選擇合適的引物濃度及優(yōu)化反應(yīng)條件來解決。本試驗所采用的引物是根據(jù)RT-PCR引物設(shè)計的原則以及根腫菌ITS基因序列設(shè)計的，基于熔解曲線和擴(kuò)增曲線來優(yōu)化反應(yīng)條件。觀察所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知曲線的回歸系數(shù)R2=0.996，反應(yīng)擴(kuò)增效率達(dá)到94.833 %，線性關(guān)系較好，從而保證了反應(yīng)的準(zhǔn)確性。用熔解曲線分析來排除假陽性的干擾，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。在分析標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線時，各基因的擴(kuò)增曲線較光滑，且擴(kuò)增曲線相鄰間距較均勻，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。因此，可進(jìn)一步確定所設(shè)置的實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系是可靠的和合理的。

RT-PCR技術(shù)檢測DNA極為靈敏。本實驗中，同一DNA樣本的Ct值的變異系數(shù)通常在1 %以內(nèi)，重復(fù)性良好，可以滿足精確實驗的要求。檢測靈敏度可達(dá)到1×101拷貝/μl。宋瓊等[15]將實時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于檢測土壤中根腫病菌休眠孢子，檢出水平為104個/g；李淼等[16]也進(jìn)行云南省十字花科蔬菜根腫病的實時熒光定量PCR檢測，靈敏度可達(dá)1×103個/g；本實驗中應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測水體中的根腫菌孢子，檢測下限至少為102個/mL。

4 結(jié) 論

本研究建立的基因熒光定量PCR檢測方法具有較好的特異性、敏感性，可用于水體中根腫菌的定量檢測，為研究根腫菌的水傳途徑打下基礎(chǔ)。