幾種中藥提取液對常見的致病菌體外抑菌及抗氧化活性的初步研究

歷雪，夏青，李艷，趙鳳勝，何秀霞

（1.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022；2.長春理工大學 校醫院，長春 130022）

食源性疾病[1-2]已經對人類的健康帶來了嚴重的危害[3]，而全世界所有食源性疾病暴發案例中，有60%以上為細菌性致病菌污染食物所致的，食品的細菌污染是指暴露于環境中的食品通過不同途徑被細菌污染，在細菌作用下腐敗變質，失去其應有的營養成分，從而影響其食用性和安全性的現象。人們在食用了被有害細菌污染的食品后，會發生各種中毒現象，同時細菌污染是最常見的食品污染之一。大腸桿菌[4]和金黃色葡萄球菌[5]是最容易感染食品的病原菌，當其含量過高時會造成食物中毒，嚴重的時也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥，與此同時金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也極容易感染傷口，引起局部化膿感染，嚴重的情況下會造成膿毒癥等全身感染。而沙門氏菌[6]和粘質沙雷氏菌[7]廣泛存在于動、植物性等其他食品中，據統計在世界各國的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌是會引起食物腐敗造成食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌，而人體攝入粘質沙雷氏菌后，當機體免疫功能降低時，則會引起肺部和尿道感染以及敗血癥，因此選取這四種病原菌作為指示菌對于實驗研究是十分必要的。

而目前食品行業普遍采用化學防腐劑來對食品和肉類進行抗菌與防腐，眾所周知，化學防腐劑雖然有一定的抗菌和防腐的作用，但是其誘癌性與致畸性對人類健康也存在潛在的危害[8]，因此開發出高效、安全、穩定的天然防腐抗菌劑[9-11]已經成為新型防腐劑研究的重要方向。我國藥典中記錄了4773種中草藥，其中研究發現有2000多種具有抑菌作用[12]，因此中藥成為了天然抗菌防腐劑的最佳資源。黃連[13-14]、迷迭香[15-16]、大蒜[17-18]在以往的文獻報道中都具有良好的抗菌效果，而獨角蓮[19]雖然有一定的毒性，但是含量較少的時候并不會造成嚴重的影響，而市面銷售的抗菌藥膏也有獨角蓮成分的添加，因此本文也選用獨角蓮作為藥物之一。但是中草藥的種類繁多，不同的中草藥對同一種微生物的抑制作用也不同，本文研究了4種中草藥對常見的致病菌的抑制作用以及抗氧化活性，并在此基礎上進行兩兩混合，以研究兩種中草藥之間是否存在促進作用，同時這也對開發天然抗菌防腐劑以及制備抗菌生態乳膏具有一定的意義。

1 實驗

1.1 材料

中藥：黃連、迷迭香、獨角蓮（吉林大藥房）、大蒜（市售）

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、粘質沙雷氏菌、沙門氏菌（來自于長春理工大學生命科學技術學院微生物實驗室）

藥品與儀器：山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯（上海生工）、DPPH（美國SIGMA公司）、牛肉膏、蛋白胨（英國OXOID公司）、752型紫外可見分光光度計（上海奧析科學有限公司）、細胞超聲破碎儀（上海安亭科學儀器）

1.2 中藥提取液的制備

將購買的黃連、獨角蓮、迷迭香，剪碎研磨，過40目篩板后，準確稱取50g，置于燒杯中，加入500mL 80%乙醇浸泡24h，超聲破碎30min，在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液。將沉淀收集起來，重復上述操作。將兩次得到的液體相加。將濾液在60℃條件下蒸發，濃縮至25mL。用濾器過濾除菌，即制得黃連、獨角蓮、迷迭香的提取液，置于4℃冰箱備用。

準確稱量200g大蒜，去皮，置于榨汁機，往榨汁機中加入400mL蒸餾水，壓榨成汁靜置48h。超聲破碎30min，在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液。將上清液于60℃條件下進行蒸發，濃縮到100mL，收集濃縮液，用濾器過濾除菌即得大蒜的提取液，置于4℃冰箱備用。以上中藥提物液，濃度均為2g/mL。

1.3 濾紙片法測定抑菌圈大小

參照濾紙片法[20-22]使用打孔器制成直徑為6mm的圓形濾紙片，滅菌后備用。夾取充分浸泡后的濾紙片貼在含菌平板上（含有乙醇的濾紙片晾干后使用），每個平板均勻貼3-4片，倒置于恒溫培養箱中進行培養，然后測量抑菌圈的大小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、粘質沙雷氏菌作為供試菌種進行抑菌實驗。

1.4 二倍稀釋法測定最小抑菌濃度

采用二倍稀釋法[23-24]，將中藥提物液稀釋成10個梯度，稀釋后的濃度為：1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、 0.125g/mL、 0.0625g/mL、 0.03125g/mL、0.0156g/mL、0.0078g/mL、0.0039g/mL、0.00195g/mL然后方法同前，采用金黃色葡萄球菌作為指示菌進行抑菌試驗。

1.5 不同中草藥提取物兩兩混合后抑菌圈大小的測定

將大蒜、迷迭香、黃連和獨角蓮提取液等比例兩兩混合，得到大蒜和黃連混合物（大+黃）、大蒜和迷迭香混合物（大+迷）、大蒜和獨角蓮混合物（大+獨）、迷迭香和黃連混合物（迷+黃）、迷迭香和獨角蓮混合物（迷+獨）、黃連和獨角蓮的混合物（黃+獨），同樣采用金黃色葡萄球菌作為指示菌進行抑菌試驗。

1.6 與常見的防腐劑進行比較

目前，我國食品中添加的防腐劑[25-26]主要為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸丙酯。參照國家食品添加劑使用標準的相關規定配制這兩種溶液。取適量的黃連、獨角蓮、迷迭香、大蒜的提取液用濾紙片法測定對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，方法同前，并與防腐劑的抑菌效果進行對比。

1.7 DPPH法測定中藥提取物的抗氧化活性

DPPH[27-28]溶液的配制：準確稱量0.004g DPPH粉末，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，DPPH濃度為1mmoL/mL，避光保存（4℃），現用現配。

（1）取中藥提物液1mL及濃度為0.1mmoL/mL的DPPH溶液3mL先后加入同一具塞試管中，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Ai。

（2）取3mL 0.1mmoL/mL的DPPH溶液與1mL甲醇混合，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Ao。

（3）取1mL大蒜水提物與3mL甲醇混合，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Aj。根據下列公式計算植物提取液對DPPH的抑制率，即：

式中，Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度；Ao為加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度；Aj為重要提取液在測定波長的吸光度。

（4）測度清除率并繪制清除率與樣品濃度曲線，通過曲線計算出IC50。IC50是指DPPH的抑制率為50%時的提取物溶液濃度。IC50越小，抗氧化能力越強。將試驗重復3次，求得抑制率的平均值。

2 結果與討論

2.1 中藥提取液對4種常見的病原菌的抑制作用

表1 幾種藥物（2g/mL）抑菌圈直徑大小

結果如表1顯示，獨角蓮對這4種病原菌均無抑制作用，黃連、迷迭香和大蒜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有一定的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的作用明顯更強，只有黃連對粘質沙雷氏菌有抑制作用。

2.2 MIC的測定

表2 幾種藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（mg/mL）

由于這幾種中藥提取液都對金黃色葡萄球菌的抑制效果更明顯，且金黃色葡萄球菌非常常見，因此選取金黃色葡萄球菌作為指示菌，由表2可知，迷迭香的最小抑菌濃度為1.95mg/mL，其次為黃連3.9mg/mL、大蒜250mg/mL，因此不同的中藥提取物對金黃色葡萄球菌的敏感性不同，金黃色葡萄球菌對迷迭香更敏感。

2.3 藥物兩兩混合后對金黃色葡萄球菌的抑制作用

將中藥提取液兩兩混合后，與原液進行抑菌圈大小的比較，由表3可知，發現了一個很有趣的現象，雖然獨角蓮沒有抑菌效果，但是加入獨角蓮提取物后，黃連和迷迭香提取物與原液相比，抑菌的效果有了一定的提高，具體機制還需要進一步研究，而其他的則無明顯效果，大蒜和其他幾種中藥的提取物混合后，其抑菌圈明顯減小，主要原因兩者沒有促進作用，大蒜的濃度降低造成的。

表3 藥物兩兩混合后對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 與常見的防腐劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用進行比較

由表4可知，除獨角蓮外的幾種中藥提取物與常見的防腐劑比較，對金黃色葡萄菌的抑制作用均優于防腐劑，其中大蒜和黃連的作用效果最強，由此可見黃連、迷迭香、大蒜均有作為天然防腐劑的潛力。

表4 幾種藥物與常見的防腐劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.5 中藥提取物抗氧化活性IC50的測定

由表5可知，迷迭香和黃連對DPPH自由基的清除能更強，其抗氧化活性能力從大到小依次為：迷迭香、黃連、獨角蓮、大蒜。迷迭香的抗氧化能力最強，其IC50值為0.325mg/mL。

表5 幾種藥物的IC50值

3 結論

不同的中藥提取液對不同的微生物有著不同的抑制作用和敏感性，研究發現黃連、大蒜、迷迭香對金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用，而其中的黃連和大蒜的抑制效果更明顯，通過與常見的防腐劑比較以及抗氧化活性試驗的研究，進一步確定了迷迭香、黃連、大蒜具有作為天然防腐劑的潛力，而通過兩兩混合藥物的研究，發現獨角蓮對迷迭香和黃連的抑菌活性具有一定促進作用，這也為日后天然防腐劑以及抗菌的生態乳膏制備中成分的添加起到了一定作用。