不同發酵劑和工藝環節對發酵牛肉調味基料抑菌性的影響

吳晨燕，樊曉盼，李秀明，王 洋，馬儷珍,*

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2.天津農學院水產學院，天津 300384）

發酵牛肉調味基料（fermented beef flavoring，FBF）以冷凍牛胴體電鋸分割過程中產生的牛骨肉末為原料[1]，在傳統工藝（熱壓浸提、酶解、美拉德反應）基礎上增加發酵工藝，此工藝制得的調味基料營養豐富、賦香效果明顯，且具有很強的抗氧化性[2]，能夠明顯改善腌肉制品的風味[3]，可廣泛應用于肉制品加工中。通過乳酸菌發酵[4]提高FBF的抑菌性，使其在肉制品中的應用前景更加廣闊。

乳酸菌的抑菌特性已被證實，學者們對乳酸菌的抑菌機制開展了廣泛的研究[5-6]。乳酸菌的抑菌作用主要體現在兩方面：首先，乳酸菌能夠發酵糖類產生有機酸、雙乙酰、過氧化氫等多種代謝產物[7-8]，通過降低環境pH值和氧化還原電位，形成不利于有害菌的生存環境，抑制食品中病原菌和腐敗菌的生長；另一方面，乳酸菌代謝產生的細菌素能夠阻止病原菌在機體內定植，提高宿主對外來菌的抵抗力[9]。FBF加工過程涉及到乳酸菌的熱滅活，研究表明，滅活乳酸菌對有害菌仍能起到很好的抑制作用。滅活乳酸菌通過自身與黏膜的吸附作用[10-11]可以抑制人和動物體內大腸埃希菌[12]、白色假絲酵母[13]等病原微生物的侵染，改善生物體內腸道菌群的組成[14]，提高機體的非特異性免疫能力[15-16]。

前期實驗中，本課題組以4 株商業復合菌薩科WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、WBX-43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、B0M-13（清酒乳桿菌）、THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）為研究對象，發現利用THM-17制得的FBF賦香效果最好，且對大腸桿菌有較好的抑制效果，為了驗證和提高FBF的抑菌性，本研究將發酵劑擴大到15 株復合或單株乳酸菌，研究FBF在不同發酵劑和工藝條件下的抑菌特性差異，以篩選出抑菌效果較好的發酵劑，應用于FBF的生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

電鋸分割冷凍牛胴體時產生的牛骨肉末（骨、肉質量比3∶7），由頂興（天津）食品科技發展有限公司提供。

1.1.2 菌種

THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）、WBX43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+類植物乳桿菌+清酒乳桿菌）、VBM-60（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌）、SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌） 意大利薩科公司；彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus，LC）、清酒乳桿菌1（Lactobacillus sake 1，LS1）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus，LPe） 東北農業大學微生物實驗室；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LPl）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，PP）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，SX）、清酒乳桿菌2（Lactobacillus sake 2，LS2）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus，SC），從薩科商業復合菌中分離得到。上述菌粉于－18 ℃冷凍貯藏，商業復合菌粉使用前于含質量分數1.5%葡萄糖的滅菌乳培養基中活化2 h；單菌接種于MRS液體培養基，37 ℃連續活化3 代，于4 ℃貯藏備用。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B），由中國農業大學微生物實驗室提供。使用前接種于LB培養基，于37 ℃連續活化2～3 代，于4 ℃貯藏備用。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基：北京索萊寶科技有限公司。

LB培養基：蒸餾水1 L、酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，NaOH溶液調節pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 試劑

風味蛋白酶（500 LAPU/g）、復合蛋白酶（1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、VB1頂興（天津）食品科技發展有限公司；酵母浸提物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉 天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；恒溫振蕩搖床 香港Blue Pand公司；Friocell 22恒溫恒濕培養箱 艾力特國際貿易有限公司；3001-1339 VarioskanFlash酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

設計3 個處理組：1）CK組（熱壓浸提-酶解-美拉德反應）；2）反應Ⅰ組（熱壓浸提-酶解-發酵），在發酵環節分別接種15 種商業復合菌或單株菌，即THM-17、WBX-43、VHI-41、WBL-45、PRO-MIX5、VBM-60、SHI-59、LPl、PP、SX、LS1、SC、LC、LS2及LPe；3）反應Ⅱ組（熱壓浸提-酶解-發酵-美拉德反應），在反應Ⅰ組的基礎上繼續進行美拉德反應。

所有處理均制備2 份。以P. aeruginoosa、E. coli、S. typhimurium、S. paratyphi B、S. aureus為目標菌，將經以上3 種處理制得的FBF作用于目標菌液，通過測定600 nm波長處的光密度（optical density，OD）（OD600nm），對其抑菌性進行研究。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 熱壓浸提

在250 mL三角燒瓶中，稱取23 g牛骨肉末和92 mL蒸餾水（牛骨肉末和蒸餾水的質量比1∶4），攪拌后于高壓滅菌鍋中熱壓浸提，0.1 MPa、121 ℃條件下浸提4 h，以充分提取牛骨肉末中的蛋白質[4]。此環節共制備62 瓶熱壓浸提液。

1.3.2.2 酶解

將62 瓶熱壓浸提液冷卻至室溫，分別添加質量分數0.06%的風味蛋白酶和質量分數0.03%的復合蛋白酶，于50 ℃搖床中同步酶解4.5 h，酶解結束后沸水浴滅酶20 min，冷卻至室溫，得到62 瓶酶解液。

1.3.2.3 發酵

取2 瓶酶解液作為CK組，不進行發酵，直接進行下一步的美拉德反應。將其余60 瓶酶解液進行發酵，在酶解液中接種活化好的發酵劑，7 種商業復合發酵劑依照產品推薦量添加，添加量為牛骨酶解液質量的0.02%，8 種單菌接種量為106CFU/mL，每種發酵劑接種4 瓶，在30 ℃、130 r/min條件下振搖發酵16 h，發酵結束后沸水浴滅菌20 min，冷卻至室溫，此時取接種不同發酵劑的發酵液各2 瓶（30 瓶），作為反應Ⅰ樣品，其余發酵液（30 瓶）繼續進行美拉德反應。

1.3.2.4 美拉德反應

向2 瓶CK組酶解液和剩余30 瓶發酵液中分別添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸和1.8% VB1，攪拌均勻后在110 ℃條件下進行美拉德反應60 min，冷卻得到2 瓶CK組和30 瓶反應Ⅱ組樣品。

1.3.2.5 離心

所有樣品均在2 ℃、5 000×g條件下離心1 min，取上清液，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 抑菌率測定

參考阮關強[17]的方法，并對其進行修改。取活化好的E. coli懸濁液100 μL，用LB液體培養基定容至10 mL，使其細菌濃度達到107CFU/mL，備用；將10 μL經過0.22 μm濾膜過濾除菌后的樣液加入到無菌96孔板中，然后加入上述細菌濃度為107CFU/mL的細菌懸濁液90 μL，以100 μL菌懸液為陽性對照，以100 μL LB液體培養基為100 μL菌懸液的空白對照，以10 μL樣液+90 μL LB液體培養基為10 μL樣液+90 μL菌懸液的空白對照，混合均勻后，在37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養。采用酶標儀測定OD600nm。各樣品對E. coli的抑制率按照下式計算。

式中：ODLB為100 μL LB液體培養基的OD值；ODE.coli為100 μL E. coli菌懸液的OD值；ODLB+FBF為10 μL FBF+90 μL LB液體培養基的OD值；ODE.coli+FBF為10 μL FBF+90 μL E. coli菌懸液的OD值。

各樣品對P. aeruginoosa、S. typhimurium、S. paratyphi B和S. aureus目標菌的抑制率實驗操作及其抑制率計算方法同上。

1.4 數據處理

使用Excel 2016軟件進行數據處理，用Sigma Plot 10.0軟件繪圖，用Statistix 8.1軟件中的Tukey HSD進行顯著性檢驗（P＜0.05）。所有組別數據均測定5 次，去掉最大值和最小值后取平均值。

2 結果與分析

2.1 不同處理組FBF對S. aureus的抑制率

由圖1可知：CK組FBF未經發酵，其對S. aureus的抑制效果較弱，抑制率僅為21%；而15 株發酵劑中，除了THM-17和WBX-43制得的FBF在反應Ⅱ中對S. aureus的抑制率有所降低外，其他處理組FBF在反應Ⅱ中對S. aureus的抑制率均明顯高于反應Ⅰ。其中，WBL-45處理組FBF，不論是反應Ⅰ樣品還是反應Ⅱ樣品，對S. aureus的抑制率均高于其他處理組，反應Ⅰ中該處理組FBF對S. aureus的抑制率為51%，反應Ⅱ則上升至58%，抑菌效果較好。

2.2 不同處理組FBF對S. typhimurium的抑制率

由圖2可知，反應Ⅰ和反應Ⅱ制得的FBF對S. typhimurium的抑制率均優于CK組。CK組FBF對S. typhimurium的抑制率為12%，增加了發酵處理的反應Ⅰ制得的FBF對S. typhimurium的抑制率在30%～50%范圍內，反應Ⅱ在反應Ⅰ的基礎上增加了美拉德反應，FBF的抑制率多處于55%～70%范圍內。其中，以LS2（清酒乳桿菌）為發酵劑制得的FBF在反應Ⅰ和反應Ⅱ 2 種體系中對S. typhimurium的抑制率分別為55%和85%，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。此外，THM-17在反應Ⅱ中抑菌性大大提高，經THM-17發酵制得的FBF對S. typhimurium的抑制率從反應Ⅰ中的33%上升至69%。

2.3 不同處理組FBF對P. aeruginoosa的抑制率

由圖3可知，FBF對P. aeruginoosa的抑制效果較弱，在3 種反應體系中，CK組和反應Ⅰ組制得的FBF對P. aeruginoosa不僅沒有抑制作用，反而能促進P. aeruginoosa的生長，采用LC（彎曲乳桿菌）發酵制得的FBF對P. aeruginoosa的促生長率甚至可達97%。經美拉德反應后，FBF對P. aeruginoosa的抑制率才有所體現，其中對P. aeruginoosa抑制效果較好的是LPl（植物乳桿菌）（66%）和LS2（清酒乳桿菌）（50%）。

2.4 不同處理組FBF對E. coli的抑制率

由圖4可知，CK組對E. coli的抑制率為61%。整體來看，反應Ⅱ組各樣品對E. coli的抑制率均比反應Ⅰ組有大幅度提高，其中變化最大的是以LPe（戊糖乳桿菌）為發酵劑制得的FBF，抑制率由17%提高到81%，增幅377%。從15 種不同的發酵劑來看，反應Ⅰ組FBF對E. coli的抑制率大多為40%～60%，反應Ⅱ組FBF對E. coli的抑制率提高到70%～80%。反應Ⅱ組各FBF中對E.coli抑制率最高的是以商業復合菌WBL-45為發酵劑制得的FBF，其對E.coli的抑制率可高達100%。

2.5 不同處理組FBF對S. paratyphi B的抑制率

由圖5可知，反應Ⅱ制得的FBF抑菌效果顯著優于反應Ⅰ和CK組制得的FBF。CK組不僅對S. paratyphi B無抑制作用，反而能促進該致病菌的生長。反應Ⅰ制得的FBF對S. paratyphi B的抑制率大多為25%～50%，其中抑制效果最好的是以SC（肉葡萄球菌）為發酵劑制得的FBF，其抑制率高達89%，以PP（戊糖片球菌）和SX（木糖葡糖球菌）為發酵劑制得的FBF對S. paratyphi B的抑制率也分別高達50%和58%。經過美拉德反應后的反應Ⅱ組FBF對S. paratyphi B的抑制率大多上升至60%～80%，經VBM-60發酵劑制得的FBF，其抑制率由反應Ⅰ組中的26%上升至99%，是反應Ⅱ組中對S. paratyphi B抑制效果最好的。

3 討 論

3.1 不同乳酸菌發酵處理組FBF的抑菌效果差異分析

在不同處理組FBF對5 株致病菌的抑菌差異研究中，復合發酵劑發酵FBF的抑菌效果多優于單菌。這是由于復合發酵劑在混合發酵時具有協同效應，會通過各自的代謝產物互相促進，提高代謝產物的產量，擴大抑菌范圍，從而提高抑菌效果[18]。本研究所用發酵劑主要為乳桿菌屬、片球菌屬及葡萄球菌屬三大類。處理篩選出的發酵劑主要有3 種：WBL-45（SX+SL+LS2）、VHI-41（SX+PP+LPl）及LS2。葡萄球菌可使蛋白質和脂肪降解，尤其是肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，它們作為肉品常用發酵劑，主要用于產香，可延緩肉制品酸敗，形成風味和氣味[19]。乳球菌屬、片球菌屬在代謝過程中能產生有機酸、過氧化氫及細菌素等活性物質，抑制病原菌和腐敗菌的生長[20-21]。研究表明，清酒乳桿菌素熱穩定性好[22]，可增大細胞膜通透性，使細胞內核酸、蛋白質類物質外泄，從而引起細胞死亡[23]。

3.2 經不同工藝環節處理所得FBF的抑菌效果差異分析

對不同處理組FBF在反應Ⅰ和反應Ⅱ中的抑菌效果進行比較，結果表明，美拉德反應能提高FBF的抑菌性。目前，美拉德反應的抑菌性已逐漸被人們認識并應用[17,24]。美拉德反應后期會形成一種棕黑色物質——類黑精[25-26]，這類物質有一定的抗氧化、抗誘變功能，對某些微生物也具有較好的抑菌活性[27-28]；Kim等[29]研究發現，在含有還原糖和胰蛋白胨的培養基中，部分菌的生長會受到抑制，而培養基中額外添加美拉德反應產物會導致菌死亡。此外，不同發酵劑在反應Ⅱ中的抑菌性存在差異，這是由于不同發酵劑生長繁殖過程中積累的代謝產物不同，因此即使FBF制作過程中僅發酵劑的種類存在差異，但其作為美拉德反應的底物[30-31]，也會使FBF的抑菌效果存在較大差異。

3.2 發酵劑對不同致病菌的抑菌效果差異分析

本研究發現，同一發酵劑對不同致病菌的抑菌效果存在差異。通過對比可以發現，實驗組FBF對P. aeruginoosa的抑制效果最差。一方面，可能是由于P. aeruginoosa為G－菌，而乳酸菌發酵劑對G+菌（尤其是親緣性較近的細菌）的抑制作用更強[32]；另一方面，P. aeruginoosa具有分泌胞外多糖形成生物被膜的能力，對環境的耐受性較強[33]；同時，P. aeruginoosa能夠產生哌嗪類色素，這些色素對外界環境有較強的抵抗能力[34]，而美拉德反應在堿性條件下會產生大量的哌嗪類物質[35]，P. aeruginoosa與FBF某些產物發生協同作用，從而促進P. aeruginoosa的生長。

4 結 論

反應Ⅱ組（熱壓浸提-酶解-發酵-美拉德反應）制得的FBF抑菌性最好，其次是反應Ⅰ組（熱壓浸提-酶解-發酵）制得的FBF，而CK組（熱壓浸提-酶解-美拉德反應）制得的FBF雖然也有一定的抑菌性，但在3 種處理中對致病菌的抑制效果最弱。在反應Ⅱ組中：以WBL-45和清酒乳桿菌為發酵劑制得的FBF抑菌性較好；以WBL-45為發酵劑制得的FBF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率顯著高于其他處理組，分別為58%和100%（P＜0.05）；以清酒乳桿菌為發酵劑制得的FBF對鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果是所有處理組中最好的，抑制率可達85%，綜合來看，WBL-45和清酒乳桿菌是適合制備FBF的發酵劑，熱壓浸提-酶解-發酵-美拉德反應工藝制得的FBF抑菌效果最好。