PLGA微米與納米載藥顆粒用于藥物攜帶與遞送的比較研究

林彥霞，白 睿，劉志強，劉惠亮

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)具有良好的生物可降解和生物相容性，是由美國食品和藥物管理局批準的可安全使用的藥用高分子材料，其降解作用可實現緩釋藥物的目的[1，2]。PLGA多聚物分子表面可以與多種生物分子通過共價或物理吸附有效結合，可以通過結合適配體、多肽及核酸等建立靶向系統，既能增大靶部位的藥物濃度又可以在體內遞送中減少創傷[3-5]。因PLGA系統具有控制顆粒大小、控制藥物釋放、延長藥物釋放時間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性、保護藥物活性、提高治療效果[6]等特點已被廣泛應用于包載藥物[7-11]。微米和納米兩種粒徑顆粒都是常用的藥物載體，但面對不同組織損傷類型，如何選擇不同顆粒類型，仍然缺乏直接的研究依據，以致不同研究報道中用法多樣[12]。本研究在表面特征、載藥能力、藥物緩釋能力，以及細胞吞噬能力等方面對兩種PLGA顆粒進行了評價，以期為如何選擇合適的PLGA顆粒提供一種策略。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實驗儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-10C型)，ChampGel攝像儀(北京賽智創業科技有限公司)，紫外分析儀(北京賓達英創科技有限公司)，紫外可見分光光度計(UV2800，上海)，CO2細胞培養箱(3111REL#5，US),超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-IID,中國)，激光粒度及電位分析儀(NANO ZS-90,英國 Malvern)。

1.1.2 實驗材料 PLGA(PLGA-50:50，由山東省藥學科學院、山東省醫療器械研究所提供)，二氯甲烷(DCM)，聚乙烯醇(PVA, sigma)，聚乙烯亞胺(PEI)，褪黑素(melatonin)，香豆素，核酸(質粒由本實驗室合成)。

1.2 方法

1.2.1 采用超聲乳化方法制備PLGA納米顆粒 載褪黑素的納米顆粒[13-15]即蒸餾水5 ml,5%PVA5 ml，二者作為外水相，油相即0.03 g褪黑素和0.10 g PLGA固體顆粒加入2 ml DCM形成乳液，超聲5～10min，制備納米顆粒。

1.2.2 采用機械攪拌乳化方法制備PLGA微米顆粒 載褪黑素微米顆粒[16-18]，方法同納米粒制備的水相和油相，溶液放于振蕩器上震蕩5～10 min，制備微米顆粒。

1.2.3 表面特征檢測 兩種顆粒采用透射電鏡、掃描電鏡和動態光散射檢測，評價其各自的表面特征，粒徑均一性。

1.2.4 兩種顆粒的載藥量，藥物緩釋 兩種載藥顆粒最后分別用2 ml水重懸沉淀，各取兩管100 μl重懸溶液，于紫外可見分光光度計下測其吸光度，同時另100 μl制備好的載藥納米顆粒與微米顆粒，測其質量，計算載藥量。兩種顆粒分別各取兩管，每管300 μl，均用500 μl PBS溶液重懸沉淀，放于37 ℃孵箱，分別收集上清于新的EP管中，最后用紫外可見分光光度計測其278 nm處的褪黑素吸光度。再根據標準曲線計算出相應的濃度，最后計算兩種顆粒的藥物累積釋放率，并繪制圖表。

1.2.5 細胞吞噬 體外培養人胚腎293T細胞株，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。按照5×104/孔將293T細胞接種在6孔板中，分四組，每組設兩個副孔，四組細胞分別于6、12、24、48 h四個時間點在熒光顯微鏡下觀察細胞吞噬情況。PLGA固體顆粒與熒光材料香豆素共溶于二氯甲烷，平分兩份分別制備微米和納米顆粒。最后制備成等量的溶液，各加6 μl氨芐西林鈉，放于4 ℃，過夜。每孔細胞各加10 μl樣品。

1.2.6 熒光強度測定 利用軟件IPP6.0分析測定細胞吞噬的熒光強度。

2 結 果

2.1 空載PLGA顆粒的表面特征 微米顆粒表面很光滑，典型的球形結構，粒徑不均一，大致范圍為3～5 μm，結果如圖1A。納米顆粒粒徑相對均一，范圍為200～300 nm，如圖1B所示。納米顆粒采用馬爾文ZS90粒度分析儀來檢測顆粒的水合粒徑，結果與掃描電鏡檢測結果相似見圖1C。微米顆粒結果如圖1D，粒徑大部分分布在2～5 μm的范圍內。

圖1 兩種空載PLGA顆粒的表面特征檢測結果

A.微米米顆粒的掃描電鏡檢測結果；B.納米顆粒的掃描電鏡檢測結果；C.納米顆粒的粒徑分布范圍；D.微米顆粒的粒徑分布范圍

2.2 藥物緩釋比較 納米顆粒存在顯著的早期突釋現象，大部分藥物在12 h內釋放，后續仍可緩慢持續釋放2～4 d，見圖2A；微米顆粒釋放時間較長，持續緩釋可達一周左右，見圖2B。

圖2 兩種顆粒的藥物緩釋圖

2.3 細胞吞噬情況 納米顆粒與細胞共孵育12 h即達到最大值，如圖3-NP，微米顆粒24 h即達到最大值，如圖3-MP。檢測熒光強度可見納米顆粒12 h即達到最大值，見圖3A；微米顆粒相對較慢，最大值出現在共孵育24 h后，見圖3B。

圖3 兩種顆粒的細胞吞噬

A.納米顆粒的細胞吞噬熒光強度，*代表12 h時熒光強度達到高峰；B.微米顆粒的細胞吞噬熒光強度，*代表24 h熒光強度達到高峰

3 討 論

多種具備生物可降解性、安全性的高分子聚合物已經被廣泛地作為藥物載體使用。其中PLGA 具有良好的生物相容性和可降解性，并且是被 FDA 批準的藥用高分子材料。因此，其作為載體包裹藥物形成顆粒是載藥系統研究領域的熱點。

在本研究中，我們制備了兩種粒徑范圍的顆粒，并且在二者的各種應用性能方面進行了比較[1,8,11,12]，評價PLGA納米顆粒與微米顆粒的表面特征、載藥能力、藥物緩釋能力及細胞吞噬能力等方面。結果顯示納米顆粒的粒徑均一性較好，可能是因為納米顆粒采用超聲技術相比微米顆粒的機械攪拌方法制得的顆粒均勻性更好，且兩種顆粒呈現出明顯的球形結構且形態規整。兩種顆粒攜帶褪黑素的能力相當，在藥物緩釋方面，納米顆粒存在顯著的早期突釋現象，大部分藥物在12 h內釋放；微米顆粒釋放時間較長，持續緩釋可達一周左右，可見PLGA納米顆粒作為化學藥物載體更適合于急性組織或細胞保護，微米顆粒更適合于慢性持續性保護；在攜帶藥物進入細胞能力方面，分別在四個時間點觀察細胞對顆粒的吞噬情況，粒徑相對小的PLGA納米粒更容易進入或與細胞結合，微米顆粒相對較慢。

本研究通過對PLGA兩種顆粒各方面進行評價，得出了二者的不同應用范疇。結果證明微米顆粒控釋系統適用于半衰期短、口服生物利用度低、需要長期使用的藥物，其優點在于幾周甚至幾個月時間內仍能釋放藥物，維持有效血液濃度，減少藥物的給藥次數，增強治療效果。緩釋的不同是因為藥物是內包于顆粒中，緩釋與顆粒的比表面積成正比[19]，與微米顆粒相比，納米顆粒粒徑小，比表面積大，故而釋放的快；對于細胞吞噬，納米顆粒由于粒徑小易被細胞吞噬，在12 h便達到吞噬高峰，而微米顆粒則24 h達到吞噬高峰，吞噬高峰之后由于進入細胞內的顆粒降解藥物釋放，故熒光強度降低。對于兩種顆粒的應用，當前很多研究報道了基于PLGA顆粒的多種修飾方法可以使顆粒系統達到藥物緩慢釋放的目的[10,20,21]，但最終能否滿足實驗要求，仍需進一步探索。

本研究結果表明，PLGA納米顆粒作為藥物控釋載體更適合于急性組織或細胞保護，微米顆粒更適合于慢性持續性保護，對于我們之后如何選擇不同粒徑的PLGA顆粒提供了參考價值，期望能夠更高效發揮兩種顆粒的應用價值。