釀酒酵母的篩選及發(fā)酵性能的比較

黃媛媛

(上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海201501)

黃酒是中國歷史最悠久的酒種，是以稻米、黍米等為主要原料，經(jīng)加曲（或部分酶制劑）、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒。在黃酒釀造中，酵母是主要發(fā)酵劑，能分解碳水化合物產(chǎn)生酒精和二氧化碳等，其發(fā)酵性能的優(yōu)劣直接影響到黃酒的品質(zhì)和出酒率[1-3]。目前國內(nèi)酒廠主要使用購買的酒藥或活性干酵母，或從黃酒發(fā)酵醪中分離篩選出性能優(yōu)良的釀酒酵母。本研究從兩種不同來源的黃酒發(fā)酵醪和活性干酵母中分離出15株酵母，通過TTC法和CO2失重法篩選出性能優(yōu)良的3株酵母進(jìn)行釀酒試驗(yàn)。對(duì)這3株酵母的產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)酸能力以及發(fā)酵液中殘余總糖、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等含量進(jìn)行了綜合比較[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種、試劑

菌源來自本公司的黃酒發(fā)酵醪、紹興某廠的黃酒發(fā)酵醪、安琪酵母股份有限公司的活性干酵母；試劑：無水酒精和NaCl為A.R.級(jí)，其余標(biāo)樣均為GC級(jí)。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁，pH4.5，121℃滅菌20min。麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁12～13°Bx，pH5.0～6.0，瓊脂2.5%，121 ℃滅菌20 min。

TTC培養(yǎng)基：上層：2,3,5－三苯基氯化四氮唑0.05%，葡萄糖0.5%、瓊脂1.5%、蒸餾水100%；下層：12～13°Bx的麥芽瓊脂汁培養(yǎng)，121℃滅菌20min。

大米糖化液：大米100%，水300%，曲5%，50～60℃糖化3～4 h過濾即可得到糖度為18°Bx左右的大米糖化液，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；超凈臺(tái)。

電位滴定儀785，Metrohm瑞士萬通；酒精計(jì)，上海華辰醫(yī)用儀表有限公司。

氣相色譜儀為agilent6890N；色譜柱DB-WAX 30 m×0.32 mm×0.25 μm；頂空進(jìn)樣器HP-7694E。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母的初篩

TTC篩選法：TTC與酵母菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)，呈紅色的菌落為產(chǎn)酒高的釀酒酵母，粉紅色菌落次之，微紅或白色菌落為野生酵母。

取安琪酵母1 g，在無菌條件下，加入麥芽汁液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h。然后取其培養(yǎng)液以及本公司、紹興某廠的黃酒發(fā)酵醅各1 mL，在無菌條件下，逐級(jí)稀釋涂布于麥芽汁平板培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋梯度平行做兩個(gè)樣，以28℃恒溫培養(yǎng)48 h，待形成單個(gè)菌落時(shí)挑取其中的單個(gè)菌落劃線分離，將純菌種接種到試管斜面固體培養(yǎng)基并于4℃冰箱中保存。

將分離的斜面菌株一一對(duì)應(yīng)涂布于TTC底層培養(yǎng)基上，并于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h左右。將溫度已冷卻為45～50℃的上層培養(yǎng)基倒在下層培養(yǎng)基上，于30℃無光條件下培養(yǎng)2～4 h后，取出立即觀察顏色，根據(jù)菌落呈色情況挑選菌種。

1.3.2 釀酒酵母的復(fù)篩

CO2失重法：在500 mL角瓶中，裝入400 mL 12～13°Bx的大米糖化液。滅菌冷卻后，接入經(jīng)24 h培養(yǎng)的液體菌種5 mL。稱重記錄原始重量，28℃培養(yǎng)，每隔24 h稱重1次，及時(shí)了解發(fā)酵速度和失重情況，待發(fā)酵終止測(cè)總失重量，以及還原糖、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、pH值。檢測(cè)方法參見國標(biāo)GB/T 13662—2008。

1.3.3 發(fā)酵性能的比較

將復(fù)篩得到的酵母進(jìn)行釀酒試驗(yàn)，對(duì)比3種不同來源的酵母的發(fā)酵性能。試驗(yàn)配方為：糯米15 kg、酒母1.2 kg、曲2.0 kg、水16 kg、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶各3 mL。

1.4 分析方法

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)：采用毛細(xì)管氣相色譜并結(jié)合自動(dòng)靜態(tài)頂空進(jìn)樣技術(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 初篩和復(fù)篩

經(jīng)TTC法篩選出15株酵母菌株后，經(jīng)CO2失重法復(fù)篩，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)為J-1至J-5（源自本公司黃酒發(fā)酵醅），S-1至S-5（源自紹興某廠的黃酒發(fā)酵醅），A-1至A-5（源自活性干酵母）。15株酵母菌的CO2總失重和發(fā)酵醪的理化指標(biāo)結(jié)果見表l。由表1可看出，菌株J4、S1、A4產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，而且發(fā)酵醪的總酸和總糖含量也較低，說明這3株酵母的發(fā)酵能力較強(qiáng)。同時(shí)，這3種不同來源而篩選出的酵母發(fā)酵性能也不同，酵母J前48 h的CO2失重最多，說明起發(fā)速度快，不易染雜菌，總酸也較低；酵母S產(chǎn)酒精能力相對(duì)較弱，但產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，平均為5.17 g/L；而酵母A產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)，平均為12.2%vol，殘余總糖也最低，平均為7.0 g/L，酵母發(fā)酵消耗糖生產(chǎn)酒精，殘余總糖越低則酒精度相對(duì)越高。

2.2 發(fā)酵性能的比較

2.2.1 產(chǎn)酒精能力的比較

發(fā)酵過程中酒精度的變化結(jié)果見圖1，結(jié)果表明：酵母J4起發(fā)速度最快，1 d時(shí)酒精度就能達(dá)到11.6%vol，產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)，最終可達(dá)19.0%vol；而酵母A4次之，1 d時(shí)酒精度為10.7%vol，最終為18.9%vol；酵母S1最弱；1 d時(shí)酒精度為9.7%vol，最終為18.7%vol。

2.2.2 殘余總糖的比較

發(fā)酵過程中殘余總糖的變化結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，酵母A4、J4、S1糖利用率都較高，發(fā)酵液中的殘余總糖都較低，分別為1.9 g/L、2.2 g/L、2.4 g/L，但是酵母S1糖利用的速度較慢。發(fā)酵液中的殘余總糖反映酵母將糖轉(zhuǎn)化成酒精的能力，如果初始糖含量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康停f明酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用率高，酒精度高，發(fā)酵能力強(qiáng)。

表1 15株酵母發(fā)酵醪失重及最后發(fā)酵醪理化指標(biāo)結(jié)果

圖1 產(chǎn)酒精能力的比較

圖2 殘余總糖的比較

2.2.3 產(chǎn)酸能力的比較

發(fā)酵過程中總酸的變化結(jié)果見圖3，結(jié)果表明，酵母S1總酸最高，可達(dá)4.95 g/L，說明其產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。酵母A4的總酸為4.77 g/L，酵母J4的總酸為4.50 g/L，產(chǎn)酸能力最弱。酸類物質(zhì)是黃酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，在黃酒中有增加濃厚感和減少甜味的作用。所以總酸含量要適中，否則會(huì)影響黃酒的口感和風(fēng)味。

圖3 產(chǎn)酸能力的比較

2.2.4 氨基酸態(tài)氮含量的比較

黃酒中含有20多種氨基酸，大多具有酸、甜、苦、咸、鮮等味道，賦予黃酒豐富的味覺層次；能被酵母進(jìn)一步代謝生成重要的風(fēng)味物質(zhì)高級(jí)醇，還能與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，是黃酒色澤的重要來源[7-9]。發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化結(jié)果見圖4，結(jié)果表明：酵母A4和J4的氨基酸態(tài)氮含量都較高，可達(dá)0.92 g/L，酵母S1的氨基酸態(tài)氮含量為0.75 g/L。

圖4 氨基酸態(tài)氮含量的比較

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)與分析

黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)由多種微量成分組合而成，包括醇、酯、醛、酸以及各種雜環(huán)類化合物等。酯類物質(zhì)主要是乳酸乙酯、乙酸乙酯等，共同形成水果香氣，對(duì)黃酒陳香有很好的襯托作用。醛類物質(zhì)主要是乙醛以及乙醛和乙醇縮合而成的乙縮醛等，具有清醇的果香味，也就是黃酒的陳香氣[10-11]。醇類物質(zhì)主要是β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇等，尤其是含量較高的β-苯乙醇，具有玫瑰花香、清甜蜜樣的香氣[12]。對(duì)3種酵母的發(fā)酵液進(jìn)行了部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果 (mg/L)

根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，對(duì)酯類的總和、高級(jí)醇和β-苯乙醇做了進(jìn)一步對(duì)比分析，如圖5所示。酵母S1的高級(jí)醇含量最高，為347.9 mg/L，同時(shí)，總酯含量也最高，為46.5 mg/L。高級(jí)醇構(gòu)成了黃酒特有的香氣骨架，但是，據(jù)相關(guān)研究表明，黃酒中的高級(jí)醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他釀造酒，而飲用黃酒引起上頭的主要原因是黃酒中高含量的高級(jí)醇[13]。高級(jí)醇在黃酒中正常的生成和合理的存在對(duì)酒質(zhì)呈香呈味有很好的積極作用，但若含量過高，會(huì)影響酒質(zhì)并對(duì)人體產(chǎn)生危害，所以必須要嚴(yán)格控制高級(jí)醇的含量[14-15]。酵母A4的β-苯乙醇含量最高，為117.1 mg/L，同時(shí)高級(jí)醇含量最低，為310.4 mg/L。總酯和β-苯乙醇含量高對(duì)黃酒在后續(xù)陳釀過程的香氣形成有較大貢獻(xiàn)，使黃酒醇香濃郁。

圖5 總酯、高級(jí)醇、β-苯乙醇含量的對(duì)比結(jié)果

3 結(jié)論

通過TTC法、CO2失重法、釀酒試驗(yàn)篩選出性能優(yōu)良的3株酵母：S1、A4、J4，都具備發(fā)酵能力較強(qiáng)、性能穩(wěn)定、產(chǎn)酸量適中等特點(diǎn)，符合釀造黃酒對(duì)優(yōu)良酵母菌種的要求，可以用到黃酒生產(chǎn)中以提高黃酒的品質(zhì)。其中從本公司發(fā)酵醪篩選出的酵母J4產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)，從紹興某酒廠發(fā)酵醪篩選出的酵母S1產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，而從安琪公司的活性干酵母中篩選出的酵母A4產(chǎn)β-苯乙醇高、產(chǎn)高級(jí)醇低。3株酵母來源不同，各有特色，在黃酒生產(chǎn)中可以復(fù)合使用這3種酵母，以達(dá)到提高黃酒產(chǎn)量、質(zhì)量和風(fēng)味的目的，其復(fù)合添加比例以及生產(chǎn)工藝有待進(jìn)一步研究。