首烏地黃酒制備工藝的優化

徐晶晶，張可擎，林麗珍，向云亞

（1.廈門醫學院藥學系，福建廈門361023； 2.河南應用技術職業學院，河南鄭州450000）

隨著生活節奏的加快，環境的不斷惡化，以及不良的飲食習慣，脫發甚至禿頂患者越來越多，這給其生活帶來了諸多不便。本課題組在前期的研究中已優化了一款外用生發酒的制備工藝[1]。中醫治療脫發的要點是辨病與辨證相結合，內服中藥和外用搽劑密切配合，缺一不可[2]。因此，本研究擬開發一款供內服的生發藥酒。

脫發、斑禿辨證無論病因如何，形式各異，最終必然導致機體肝腎機能下降、精血虧虛，這是本病的主要病因，而情志不暢是本病的誘因。所以應以養血益腎為主，當歸、首烏、地黃為必用之藥[3]。司氏[4]檢索1980年至2014年中國期刊全文數據庫收錄的中醫及中西醫結合診治脫發、白發的臨床研究和個人經驗類文獻，共涉及中藥統計有269味，發現使用頻率最高的5味藥依次為何首烏、當歸、熟地黃、川芎、女貞子，這也體現了中醫對于脫發的治法以補腎養血活血為主。首烏地黃酒由制首烏、熟地、黃芪、當歸、川芎、枸杞6味中藥組成，全方具有補肝腎、和氣血、烏須發的作用，用于精血不足、未老先衰、須發脫落或早白[5]。

目前酒劑的常用制備方法為浸漬法(冷浸法和熱浸法)、滲漉法和回流提取法等[6]。中藥有效成分是中藥復方發揮治療作用的物質基礎，而總固體含量影響制劑澄清度和成品的穩定性[7-8]。本實驗以該方中君藥何首烏的主要活性成分游離蒽醌含量為主要考察指標，通過正交實驗對該藥酒制備工藝進行優化，同時結合總固體量綜合優選出最佳提取工藝，可為首烏地黃酒的質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

制首烏、熟地、黃芪、當歸、川芎、枸杞藥材均購自北京同仁堂，均符合2015年版《中國藥典》一部各藥材項下規定的標準。

試劑：大黃素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16071004，純度＞98%)，大黃素甲醚(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16070403，純度＞98%)，水為純凈水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

儀器：Waters2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；CP124C型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；RT-04型粉碎機，北京興時利和科技發展有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離蒽醌的含量測定

1.2.1.1 樣品前處理

取首烏地黃酒適量，進樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.2.1.2 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20），檢測波長為254 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量10 μL。

1.2.1.3 標準曲線繪制

精密稱取大黃素對照品5.06 mg，大黃素甲醚對照品2.44 mg，分別置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液。精密吸取大黃素和大黃素甲醚對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得大黃素和大黃素甲醚系列對照品溶液。將各對照品溶液在選定的色譜條件下測定，以濃度為縱坐標、峰面積為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 總固體含量的測定

精密量取供試品上清液50 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在105℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量[9]。

1.2.3 正交實驗設計

選用L9(34)正交實驗，以游離蒽醌含量（含游離蒽醌以大黃素和大黃素甲醚的總量計）、總固體含量的綜合評分為指標考察乙醇體積分數(A)、料液比(B)和提取時間(C)對提取效果的影響，從而確定最佳提取工藝條件。權重分配游離蒽醌含量占0.7，總固體含量占0.3。具體計算方法為9個樣品中，每個樣品的游離蒽醌含量、總固體含量分別除以9個樣品中游離蒽醌含量、總固體含量的最大值，然后乘以權重系數，得到游離蒽醌含量、總固體含量在該樣本中的綜合評分的貢獻值，同一樣品的游離蒽醌含量、總固體含量貢獻值之和即為該樣品的綜合評分[10]。因素水平見表1。

表1 首烏地黃酒的制備工藝正交實驗因素水平

1.2.4 驗證實驗

按比例稱取各藥材粗末適量，按最佳工藝條件重復3次實驗，檢測游離蒽醌含量和總固體含量，驗證該工藝條件的穩定性。

2 結果與分析

2.1 游離蒽醌的含量測定

2.1.1 色譜條件的確定

2015版《中國藥典》及嚴氏對何首烏中游離蒽醌進行色譜分離時，使用的流動相均為甲醇∶0.1%磷酸溶液=80∶20[11-12]。通過實驗發現此條件對于首烏地黃酒中游離蒽醌的分離同樣適用，可以實現2種待測物質大黃素、大黃素甲醚與藥酒中其他化合物的分離，雜質干擾少。見圖1。

圖1 首烏地黃酒的HPLC色譜圖

2.1.2 標準曲線及線性范圍

以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，大黃素和大黃素甲醚回歸方程分別為Y=32961X+2254.4（R2=0.9998）；Y=10238X+3497.3（R2=0.9995），線性范圍分別為2.53～50.6 μg/mL和2.44～48.8 μg/mL，線性較好。

2.1.3 穩定性實驗

取同一供試品溶液，分別放置0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h按照1.2.1.2處的色譜條件進樣，測得大黃素和大黃素甲醚質量濃度的RSD分別為0.8%、1.0%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.4 精密度試驗

分別取1.2.1.3項的大黃素和大黃素甲醚高、中、低3個質量濃度的對照品溶液，按照1.2.1.2處色譜條件每個濃度分別重復進樣5次，大黃素和大黃素甲醚高、中、低質量濃度的RSD分別為0.5%、0.4%、1.0%；0.4%、0.5%、0.8%。表明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復性實驗

取首烏地黃酒樣品，按照1.2.1.1處的處理方法平行制備5份，按照1.2.1.2項的色譜條件進樣，計算含量。其大黃素和大黃素甲醚含量RSD分別為0.8%、0.6%。表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率實驗

精密量取已知含量的首烏地黃酒1 mL，分別按含量的80%、100%、120%加入大黃素和大黃素甲醚對照品溶液，按照1.2.1.2處色譜條件進樣，計算大黃素和大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為100.5%、100.1%、100.7%；100.8%、101.0%、100.6%，RSD為0.8%、0.9%、1.2%；1.6%、0.7%、0.9%，結果見表2。

表4 綜合評分方差分析

2.2 正交實驗結果

試驗安排及結果見表3，方差分析見表4。由表3極差分析結果可知，各因素對結果的影響順序為A＞C＞B，即乙醇體積分數＞提取時間＞料液比。由表4方差分析可知，乙醇體積分數對提取工藝有顯著影響，并根據綜合評分結果，選擇最優工藝條件A3B1C2，即乙醇體積分數60%vol，料液比為1∶8，提取時間30 d。

2.3 驗證實驗

按比例稱取各藥材粗末適量，按最佳工藝條件A3B1C2重復3次試驗，驗證該工藝條件的穩定性，結果游離蒽醌的平均含量為0.685 mg/g，總固體的平均含量為0.52%，結果無顯著性差異，證明該工藝穩定可行。

3 結論

采用正交實驗法以游離蒽醌含量、總固體含量的綜合評分為指標，考察乙醇體積分數、料液比、浸提時間對首烏地黃酒冷浸法制備工藝的影響。實驗結果表明首烏地黃酒的最優制備工藝條件為：乙醇體積分數60%vol，料液比為1∶8，浸提時間為30 d。