干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片光合、葉綠體超微結構和抗氧化系統的影響

郭愛霞, 石曉昀, 王延秀, 胡 亞, 朱燕芳

(甘肅農業大學園藝學院,甘肅 蘭州 730070)

蘋果(Maluspumila)是我國重點果產區的支柱性產業[1-2]，而西北黃土高原因具備適于蘋果生產的自然條件而成為我國蘋果的最優生態區，栽培面積占全國蘋果總種植面積的44%，產量占全國蘋果總產量的49%[3]，但黃土高原多為干旱或半干旱雨養農業區，水分虧缺成為制約植物生長的主要因素[4]，而且果樹對干旱脅迫反應敏感。水分脅迫下，果樹對水分和養分的吸收減少，正常的生理活動，如光合代謝等受到干擾，體內有機物的積累和轉運受滯，進而嚴重影響樹體的生長發育和果實的產量品質[5-6]。因此，在水分供應不足的地區，篩選并應用抗旱性較強的砧木對果樹的節水、優質高產具有重要意義[7-8]。

前人已經探討了不同植物對干旱脅迫的生理響應機制，主要集中于生理生化、形態結構和基因表達的差異。干旱脅迫下植物的生理功能發生顯著變化，高杰等[9]對玉米的研究結果表明，干旱脅迫下玉米干物質積累量、葉面積、株高顯著下降，光系統Ⅱ和抗氧化酶系統損傷，光合速率下降。季楊等[10]針對干旱脅迫對鴨茅根及葉的保護酶活性、滲透物質含量及膜脂過氧化作用的研究表明干旱脅迫誘導2種基因型的鴨茅根系及葉片細胞產生活性氧，發生氧化反應，破壞細胞膜而降低酶活性。李澤對油桐的研究表明干旱下，SPAD、Pn、Gs、Tr、Fv/Fm及qP值降低[11]。植物細胞中的葉綠體對逆境脅迫比較敏感，干旱脅迫下葉綠體的形態、結構和大小數目均會發生變化，Zhang等[12]對甘蔗做了相關研究，發現干旱脅迫下細胞發生質壁分離，葉綠體由長橢圓變為近圓形，并向細胞中心靠近，淀粉粒變小消失。徐萍等[13]研究了干旱脅迫對銀沙槐幼苗葉綠體超微結構的影響，結果表明干旱脅迫下銀沙槐細胞的葉綠體變形，外被膜波浪狀、斷裂不完整；基粒和基質類囊體膜結構模糊，基粒彎曲膨脹。Rampino[14]研究了普通小麥和山羊草在分子水平上響應干旱脅迫的差異，結果發現通過RT-PCR分析的DHN基因在供水充足的小麥中不表達，而在受脅迫的植物中表達。Yoshimura利用差異蛋白質組學研究認為，旱生植物野生西瓜在脅迫過程中由避旱性轉變為耐旱性，通過時間程序化的方式調節它的根蛋白質組[15]。

目前對蘋果屬植物的耐旱性研究較多[16-17]，但多數僅從生理特性或解剖結構單方面進行抗性比較，而結合PSII光合系統、抗氧化系統和葉綠體超微結構的變化來綜合評價蘋果砧木抗旱性的研究未見報道。本試驗以新疆野蘋果(MalussieversiiRoem.(XJ))、垂絲海棠(MalushallianaKoehne(CS))及山定子(MalusbaccataBorkh.(SDZ))為研究對象，初步探討了這三種蘋果砧木的干旱適應機制，運用相關性分析和主成分分析法綜合評價它們的抗旱性，旨在為蘋果抗旱砧木的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗于2016年4—6月在甘肅農業大學園藝學院避雨棚進行。選取生長一致的新疆野蘋果(XJ)、垂絲海棠(CS)及山定子(SDZ)一年生幼苗，移入盛裝基質(20%蛭石，20%珍珠巖，60%泥炭)重量為0.65 kg的花盆(內徑10 cm，深18 cm)中，每盆1株，統一管理30 d后，進行盆栽控水脅迫，分為正常供水(土壤含水量為田間持水量的75%～80%)和干旱脅迫(土壤含水量為田間持水量的45%～50%)兩個處理，每個處理30盆幼苗。采用持續稱重法控制土壤含水量，每隔3 d傍晚稱重并補充水分。當最大田間持水量為100%時，土壤凈含水量為48%。試驗所設處理分別為新疆野蘋果正常供水(XJ75)及干旱脅迫(XJ50)苗木、垂絲海棠正常供水(CS75)及干旱脅迫(CS50)苗木、山定子正常供水(SDZ75)及干旱脅迫(SDZ50)苗木，從脅迫前1天(記為第0天)開始，每隔7 d測定一次各項指標，重復5次。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合參數的測定 從脅迫處理0 d開始，每隔7 d上午9∶00選取生長一致的幼苗相同節位的葉片，將各項指標逐一測定，重復5次。用Li-6400光合儀(LI-COR公司，美國)測定第8片真葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。設定CO2濃度為400 μmol·mol-1，環境溫度25℃，光強為800 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 葉綠素熒光參數的測定 在暗適應后，設置測量光飽和閃光后夾好葉片，用Li-6400光合儀(LI-COR公司，美國)測定熒光參數，等待dF/dt絕對值<5時記錄數據，計算PSII最大光化學效率(Fv/Fm)、PSII潛在光化學活性(Fv/Fo)、光化學猝滅系數(qP)、非光化學猝滅系數(NPQ)等光合熒光參數，重復測定5次。

1.2.3 透射電鏡切片的制備 干旱脅迫28 d后，取對照及處理植株新梢頂端(形態學頂端)完全展開的第4片幼葉，用去離子水沖洗干凈后，將葉片剪成1 mm×1 mm的組織塊，立即投入用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)配制的3%戊二醛中抽氣5～8 min，組織塊下沉后，用PBS配制的3%戊二醛于4℃下固定12 h，PBS沖洗3次，每次15 min；用PBS配制的1%鋨酸在4℃下固定2 h，用PBS沖洗3次，每次15 min；乙醇梯度脫水，依次用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇浸泡，每梯度脫水15 min，再用純丙酮脫水2次，每次15 min；脫水后進行滲透與包埋,100%丙酮∶包埋劑=1∶1，滲透5 h，然后換成純包埋劑包埋16 h(包埋劑由9.12 mL環氧樹脂Epon812+4.7 mL 軟化劑MNA+6.15 mL硬化劑DDSA+0.3 mL催化劑DMP-30 配制而成)，最后在36℃下聚合12 h，72℃下聚合48 h。

用LEICA EM UC6 Miultracut超薄切片機(Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany)切出厚度約為70 nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，用TECNAI G2(TF20)型透射電鏡(FEI，USA)對葉片葉綠體超微結構進行觀測，超薄切片每種植物每個處理觀察20個視野并照相。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 使用高錳酸鉀滴定法[18]測定過氧化氫酶(CAT)活性；NBT光還原法[19]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性；愈創木酚法[20]測定過氧化物酶(POD)活性。

1.3 數據處理

用Excel 2013進行數據統計整理，使用軟件origin 9.0作圖，采用R語言軟件進行相關性分析，采用SPSS 22.0進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對三種蘋果砧木葉片光合特性的影響

如圖1A所示，與正常供水處理相比，干旱脅迫下， 3種蘋果砧木的凈光合速率(Pn)降低，隨著脅迫時間的持續，XJ、CS和SDZ的Pn均呈下降趨勢，脅迫28 d后，它們的Pn分別降低了35.20%、12.75%、43.13%，表明CS的Pn受干旱脅迫的影響較小。3種蘋果砧木的氣孔導度(Gs)變化趨勢基本與Pn的變化趨勢相似(圖1B)，干旱脅迫下XJ、CS和SDZ的Gs顯著下降，隨著脅迫時間的持續，CS的氣孔導度下降了7.10%，降幅小于XJ和SDZ。 干旱脅迫下，3種蘋果砧木的Tr均顯著降低(圖1C)，脅迫處理28 d后，XJ、CS和SDZ的Tr降幅分別為：29.40%、16.58%、35.94%，CS的降幅小于XJ和SDZ，說明CS受干旱脅迫的影響程度要小于XJ和SDZ。如圖1D，相比正常供水處理，干旱脅迫下胞間CO2濃度(Ci)的變化趨勢與前3個光合參數變化趨勢相反，隨著干旱脅迫的持續，XJ、CS和SDZ的Ci均呈現上升趨勢，其中CS的增幅較大。

2.2 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片光合熒光特性的影響

從圖2A可知，干旱脅迫期間，XJ、CS和SDZ的最大光化學效率(Fv/Fm)與對照相比均呈現下降趨勢，降幅分別為：13.32%、7.04%、14.23%，其中CS的降幅低于XJ和SDZ。XJ、CS和SDZ潛在光化學活性(Fv/Fo)的變化趨勢與Fv/Fm相似(圖2B)，干旱脅迫顯著降低了3種蘋果砧木的Fv/Fo，脅迫處理28 d后，CS的降幅較XJ和SDZ小。如圖2C所示，隨著干旱脅迫時間的延長，3種蘋果砧木的光化學猝滅系數(qP)均呈下降趨勢，XJ的qP下降了18.17%，CS和SDZ的qP分別下降了5.96%和22.01%，CS的降低程度明顯低于XJ和SDZ。隨著干旱脅迫的持續，3種砧木葉片的非光化學猝滅系數(NPQ)均呈上升趨勢(圖2D)，在脅迫28 d后，增幅分別為12.78%、20.74%、7.37%，CS的NPQ增幅較XJ和SDZ的大。

2.3 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片葉綠體超微結構的影響

正常供水條件下，3種砧木的葉肉細胞具有清晰、光滑、連續的細胞膜和細胞壁，葉綠體均為橢圓形，并緊貼細胞壁分布，每個葉綠體中具有1～2個淀粉顆粒，葉肉細胞內有一個大的液泡(圖3A、C、E)；核仁和染色質在核基質中分散(圖3A)；基質中含有線粒體和許多質體小球及較大淀粉粒的組織良好的葉綠體(圖3A、C)。干旱脅迫下，3種砧木葉肉細胞表現出明顯的結構變化，出現明顯的質壁分離現象，淀粉粒縮小甚至消失(圖3B、F)；染色質和核仁縮合甚至消失(圖3B)；葉綠體腫脹，但淀粉顆粒和線粒體基本無變化(圖3D)；葉綠體發生變形和空泡化，線粒體和質體小球消失(圖3F)。3種砧木的葉綠體超微結構受到不同程度的傷害，但相比其他兩種砧木，CS的葉片超微結構損傷較小，能較好地保持細胞結構的完整性。

注：XJ75-新疆野蘋果正常供水；CS75-垂絲海棠正常供水；SDZ75-山定子正常供水；XJ50-新疆野蘋果干旱脅迫；CS50-垂絲海棠干旱脅迫；SDZ50-山定子干旱脅迫。下同。Note: XJ75 represents adequate water supply condition of Malus sieversii Roem; CS75 represents adequate water supply condition of Malus halliana Koehne; SDZ75 represents adequate water supply condition of Malus baccata Borkh; XJ50 represents drought stress of Malus sieversii Roem; CS50 represents drought stress of Malus halliana Koehne; SDZ50 represents drought stress of Malus baccata Borkh. The same below.圖1 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片光合特性的影響Fig.1 Effects of drought stress on photosynthetic characteristics of leaves of three apple rootstocks

圖2 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片熒光特性的影響Fig.2 Effects of drought stress on fluorescence characteristics of leaves of three apple rootstocks

注：A、C、E為正常供水條件下的XJ、CS、SDZ，B、D、 F為水分脅迫下的XJ、CS、SDZ。CW：細胞壁；Ch：葉綠體；Sg：淀粉顆粒；Chr：染色質；Pg：質體小球；Nu：核仁；M：線粒體；V：液泡；Vs：基質片層囊泡化。Note：A, C, and E denote XJ, CS, and SDZ under control conditions, respectively. B, D, and F denote XJ, CS, and SDZ under drought conditions, respectively. CW: cell wall; Ch: chloroplast; Sg: starch grain; Chr: chromatin; Pg: plastoglobule; Nu: nucleolus; M: mitochondrion; V: vacuole; Vs: vesiculation of stroma lamellae.圖3 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片葉綠體超微結構的影響Fig.3 Effects of drought stress on chloroplast ultrastructure of leaves of three apple rootstocks

2.4 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片抗氧化系統的影響

2.4.2 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片抗氧化酶活性的影響 干旱脅迫下，CS、XJ以及SDZ的SOD和CAT活性均呈先上升后下降的變化趨勢(圖5A和圖5C)，脅迫處理14 d時，它們的SOD和CAT活性均達到最大值，整體呈升高趨勢；從圖5B可知，脅迫處理前21 d，3種砧木的POD活性呈現升高趨勢，21 d之后趨于平穩。總體來講，CS的SOD、POD和CAT活性增幅高于XJ和SDZ。

2.5 3種蘋果砧木葉片各生理指標的相關性分析

圖4 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片MDA含量和產生速率的影響Fig.4 Effects of drought stress on MDA content and production rate of leaves of three apple rootstocks

圖5 干旱脅迫對3種蘋果砧木葉片抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of drought stress on activities of three kinds of antioxidant enzymes of leaves of three apple rootstocks

2.6 3種蘋果砧木葉片各生理指標之間的主成分分析

3 討 論

3.1 干旱脅迫下3種蘋果砧木葉片光合特性的分析

干旱脅迫期間，植株的正常光合作用受到氣孔和非氣孔限制因素的影響，Farquhar 和Sharkey[21]研究發現，引起光合速率降低的氣孔或非氣孔限制因素可以根據Ci的變化方向來判斷，當光合作用和Ci均降低時，光合作用受到了氣孔限制因素的影響，相反，Ci升高則光合作用受到非氣孔限制的影響。也有研究[22]表明水分脅迫下蘋果幼苗葉片的Pn、Gs和Ci均顯著降低。本研究中，3種蘋果砧木的Pn、Gs和Tr隨著干旱脅迫的持續均呈下降趨勢，而Ci則呈現升高趨勢，所以干旱脅迫下造成蘋果葉片光合作用下降的因素是非氣孔限制，而非氣孔限制因素是由于光合細胞機構和功能受到了損傷導致的。一年生的3種砧木幼苗，可能是由于長期培養于避雨棚中，受光條件較弱，蘋果葉片質地較薄，因此Pn值均偏小。而CS在干旱脅迫期間，Pn、Gs、Tr和Ci的變化幅度顯著低于XJ與SDZ，可能是由于其葉片利用熒光或熱能耗散的形式，阻止過多光能向PSII光系統中心傳遞，以保護光合作用機構免于強光破壞，有利于光合作用正常進行，這與Singh的研究結果相類似[23]。

注：圖中黑色圓圈表示兩者呈正相關，白色圓圈表示兩者呈負相關，圓圈越大，相關性越高。Note: The black circles in the figure indicate a positive correlation between the two indices, the white circle indicate a negative correlation between the two indices. The larger the circles, the higher the correlation.圖6 3種蘋果砧木葉片各生理指標間的相關系數Fig.6 The correlation coefficient between the physiological indexes of leaves of the three apple rootstocks

項目Item第一主成分PC1The first principalcomponent第二主成分PC2The second principalcomponent特征根Eigenvalue9.2023.603方差貢獻率/%Variance contribution rate70.78527.718累積方差貢獻率/%Cumulative contribution rate98.502

表2 各主成分的特征向量

表3 各主成分得分及綜合得分

葉綠素熒光參數是干旱脅迫期間量化植物水分狀況的一種工具，能夠快速、準確、無傷害地反映干旱脅迫對光合作用產生的影響[24]。Fv/Fm和Fv/Fo是反映PSII反應中心光合潛能的重要參數；qP反映PSII天線色素捕獲的光能用于光化學電子傳遞的份額，其下降幅度越小，表明越抗旱；NPQ反映PSII天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的部分，較高的NPQ有利于過剩光能的及時耗散，從而避免光系統的損害[25]。干旱脅迫下，PSII光系統通過提高非輻射性熱耗散，消耗PSII吸收的過剩光能，從而保護PSII反應中心免受因吸收過多光能而造成的光氧化傷害[26]。從本研究結果可知，隨著干旱脅迫時間的延長，XJ、CS和SDZ的Fv/Fm、Fv/Fo和qP均降低，NPQ上升，表明干旱脅迫導致三種砧木光合電子傳遞受阻，類囊體膜受到損傷引起光合速率下降，與其它兩種砧木相比，CS的Fv/Fm、Fv/Fo和qP降幅較低，NPQ的上升程度較高，表明干旱脅迫下CS具有較強的熱耗散和電子傳遞能力，PSII中心光能轉化效率較高，具有較高的光能利用率，對干旱脅迫的適應能力強，這與牛鐵泉[22]等的研究結果相一致。

3.2 干旱脅迫下3種蘋果砧木葉片超微結構的分析

正常供水條件下，葉肉細胞中的葉綠體都緊貼于細胞壁，這種分布方式有利于大氣中的CO2向葉綠體中擴散，促進光合作用[27]。干旱脅迫下，細胞液泡收縮，核染色質凝聚，細胞發生質壁分離，葉綠體膜結構被破壞，淀粉粒變小消失，葉綠體彎曲膨脹，基粒類囊體空泡化[17]。本試驗結果發現，與XJ和SDZ相比，干旱脅迫期間CS的葉綠體受傷害程度較輕。葉綠體是生成活性氧(ROS)的主要來源，所以易受氧化損傷的影響，對干旱脅迫反應較敏感，而超微結構的損傷程度間接取決于調節ROS水平的抗氧化酶濃度的變化，由于CS的SOD、POD和CAT水平高于XJ和SDZ，干旱脅迫期間酶活性降幅也較低，所以CS的膜脂過氧化程度較低，葉綠體細胞膜受損較輕，與前人研究一致[17]。

3.3 干旱脅迫下3種蘋果砧木葉片抗氧化系統的分析

主成分分析(PCA)方法將原來眾多具有一定相關性的多個指標重新組合成一組新的互相無關的綜合指標，消除了數據之間的相關性[34]，操作簡單，沒有參數限制，可應用于多方面研究[35]。為了全面綜合地比較干旱脅迫下3種蘋果砧木的抗旱性，本試驗采用PCA對3種砧木的所測指標進行評價排序，將原來的13個指標簡化為2個主成分，對這2個主成分的載荷進行分析發現，干旱脅迫下CS的PCA得分高于XJ和SDZ，說明CS的抗旱性較強。

4 結 論

對干旱地區常用蘋果砧木新疆野蘋果、垂絲海棠和山定子進行抗旱性評價發現，垂絲海棠能在干旱脅迫下保持葉綠體結構的完整性，激活抗氧化酶系統，清除氧化產物而保持較高的光合能力。根據PCA綜合分析得出，垂絲海棠的抗旱性強于新疆野蘋果和山定子。