循環腫瘤細胞檢測在結直腸癌中的應用專家共識(2018)

中國研究型醫院學會微創外科學專業委員會,《腹腔鏡外科雜志》

1 背 景

近年，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發病率與死亡率在全球范圍內不斷攀升，已成為威脅人類健康的第三大癌癥。隨著手術、放化療及靶向治療等綜合治療手段的應用，CRC患者的預后得到有效改善，其5年生存率、10年生存率已分別達到65%與58%。盡管如此，仍有一半以上的CRC患者在疾病進展過程中會出現腫瘤復發、遠處轉移，并最終導致死亡[1]。因此，如何有效監測疾病進展并準確判斷預后一直是CRC研究領域的熱點。

1869年，澳大利亞病理學家Thomas Ashworth首次報道了循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的存在，但CTCs真正進入人們視野則始于20世紀90年代中期。研究表明，CTCs來源于原發腫瘤細胞的克隆[2]，存在于CRC發生的早期階段[3]，并且在腫瘤形成、發展、轉移過程中發揮重要作用[4]。相較傳統組織學活檢，CTCs檢測作為一種“液態活檢”，具有創傷小、可重復檢測、特異性及敏感性高等優勢，可提供關于CRC患者疾病狀態的實時信息，有助于CRC的早期篩查、預后評估及治療反應監測等，為CRC的診治開辟了新視野[5]。

2 定義及特性

2.1 CTCs的定義 CTCs是從原發或繼發腫瘤脫離進入循環系統的腫瘤細胞。其中部分腫瘤細胞經歷上皮—間質轉化等過程獲得高侵襲性，而大多數CTCs則被機體免疫系統直接消滅，或啟動凋亡程序，成為凋亡CTCs，僅約0.01%的CTCs可形成轉移性病灶[6]。此外，循環系統中還存在循環腫瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)，其來源尚不明確，可能由原發灶直接脫落[7]或由CTCs聚集形成[8]。另有一些CTCs大小、形狀與白細胞相似，被稱為小CTCs[9]。

2.2 CTCs的特性 (1)稀有性：與其他循環細胞相比，CTCs數量非常稀少，在CRC患者外周血液中為1～10個/mL[10]。(2)異質性：CTCs在時間、空間上表現出高度異質性，不同亞群CTCs在CRC的發生與發展過程中可能發揮不同作用，高敏感度的單細胞分析在單細胞水平上觀察到CTCs蛋白質表達、蛋白質定位的高度時間與空間異質性，提示我們除CTCs計數外，這些異質性信息可能蘊含著潛在的臨床價值[11]。

3 CTCs的檢測技術

CTCs在外周血中分布極其稀少，通常約108個白細胞、5×1010個紅細胞中僅能捕獲數個CTCs[12]，因此目前的檢測策略一般分為兩步，首先根據其特性進行分離富集，再對富集的可疑細胞進行鑒定，以確定為CTCs。

3.1 CTCs的分離富集技術 CTCs與血細胞在物理特性、免疫學特性、基因表達等方面均存在差異，這些差異構成了分離CTCs的理論基礎。

3.1.1 基于物理特性的分離富集技術 其優勢在于不破壞CTCs形態，不依賴CTCs的表面抗原，同時兼容多種下游分析技術，利于后續對單個CTCs進行形態學、免疫細胞學及遺傳學特征的研究。

其中ISET系統、CTC-Biopsy系統屬于“微過濾”裝置，核心部件是一個分布有一定直徑濾孔的濾器，主要依據CTCs與正常的血源性及非血源性細胞體積大小的差異從外周血中分離富集CTCs[13-14]。Clearcell FX系統、Parsortix系統采用微流控原理，核心部件為微流控芯片，不僅依據CTCs的大小特性，同時考量其形變能力，對其進行分離富集[14-16]。OncoQuick系統采用密度梯度離心法分離CTCs，主要依據CTCs與白細胞密度差異進行分離富集，密度梯度離心后白細胞經過多孔濾膜濾除，而CTCs被富集于介質層中[17]。DEPArray系統采用介電電泳方法分離CTCs，根據CTCs介電力的大小精準有效地分離富集出CTCs[18]。

3.1.2 基于腫瘤細胞免疫學特性的分離富集技術 主要依據免疫學原理，應用磁珠、黏附、白細胞去除等方法通過陽性富集或陰性富集進行CTCs的分離富集。陽性富集是利用腫瘤相關抗原的特異性抗體對CTCs進行捕獲，陰性富集是利用白細胞特異性表面抗原去除白細胞后富集CTCs。

采用磁珠法的CellSearch系統是陽性富集方法的代表，先用EpCAM抗體標識的微磁珠由全血中捕獲可疑細胞，再將EpCAM(+)CK(+)CD45(-)DAPI(+)細胞定義為CTCs。CellSearch系統作為一種流程較成熟的檢測技術，為CTCs檢測技術的完善、革新起到巨大作用，但也存在諸多局限，如發生上皮—間質轉化的CTCs可表現為EpCAM陰性導致無法被富集，部分EpCAM表達減弱、被血細胞包裹等的CTCs容易被漏檢，非血細胞、非惡性的循環細胞因表達EpCAM從而引起假陽性。由于CTCs表面抗原的異質性，很大程度上制約了陽性富集方法的效果[19]。此外，同樣采用CTCs陽性富集技術的還有CTC-Chip系統、AdnaTest癌細胞檢測系統、MACS系統、RARE系統等[20]；采用陰性富集技術的代表是Cyttel系統，其利用特制的CD45免疫磁珠吸附血液中的白細胞，從而分離富集CTCs[21]。

3.2 分離富集與鑒定技術的結合 分離富集后的可疑CTCs需要通過可靠的鑒定才能確定為CTCs，目前鑒定方法主要有細胞水平與分子水平兩個層面。近年關于CTCs綜合檢測技術的研究眾多且日趨成熟，涌現出一批分離富集與鑒定技術相結合的半自動化、自動化檢測平臺。常見CTCs檢測平臺及其特性見表1。

表1 常見CTCs檢測平臺及其特性

CTCs作為一種直觀可靠的腫瘤檢測指標，正迅速成為CRC早期診斷、輔助分期、預后判斷、療效及復發監測等診療過程中重要的檢測手段。目前，可應用于CRC患者的CTCs檢測方法雖種類繁多，但尚無權威性的整體解決方案，尤其在自動化結果判讀等方面亟需發展更加靈敏、特異、快速的檢測體系。

4 CTCs的檢測流程

目前商品化的CTCs檢測平臺眾多，Janssen公司CellSearchTM系統通過免疫磁珠法陽性富集CTCs，友芝友公司CTC-Biopsy?系統通過高分子材料微孔濾膜過濾裝置分離富集CTCs，兩者分別應用了基于生物學特性與物理特性的分離富集技術，在目前眾多檢測技術中具有代表性，下面分述兩種系統的檢測流程。

4.1 CellSearchTM系統的檢測流程 (1)CellSearchTM系統單次檢測需要全血7.5 mL，血液樣本儲存于檢測系統配置的CellSave儲存管內，管內含有EDTA與專利防腐劑，血液樣本可在室溫(15℃～30℃)下保存96 h，期間可維持CTCs形態與抗原表達，方便批量處理、遠途運輸。(2)CellTracks?AutoPrep?系統自動化的樣本制備裝置，可捕獲CTCs并染色，完成標準化的分析前制備(加入緩沖液及EpCAM抗體包被的磁顆粒→磁孵育→吸出液體及未結合的磁顆粒→移除磁場使標識細胞重新懸浮→加入CK抗體、CD45抗體、DAPI進行染色)。(3)在MagNest?裝置恒定的強磁場作用下，經過分析前制備的細胞移至樣本盒的分析表面，形成單細胞層。(4)CellTracks AnalyzerII?系統采用熒光光學技術自動掃描與計數捕獲細胞，當形態類型、染色類型[EpCAM(+)CK(+)CD45(-)DAPI(+)]與設定相符時，將相應細胞歸類為CTCs。(5)人工復檢驗證形態學特征與染色類型，鑒定CTCs。見圖1。

4.2 CTC-Biopsy?系統的檢測流程 (1)CTC-Biopsy?系統單次檢測需要全血5 mL，使用BD Vacutainer?K2E(EDTA)10.8 mg 6.0 mL抗凝真空采血管，經由靜脈采集5 mL外周血，血液樣本采集后立即輕柔顛倒混勻8次，以免凝血。為防止溶血，建議血液樣本在2 h內檢測，如果條件限制不能完成檢測時，需置于4℃環境靜置保存；處理樣本時，需室溫靜置復溫20 min；血液樣本保存時間不能超24 h。需要遠距離運輸的血液樣本，在運輸過程中應保持采血管豎直向上并置于4～8℃采血箱內，運輸過程避免冰袋與采血管直接接觸，防止劇烈晃動。對于行腹腔鏡手術治療的CRC患者，CTCs檢測樣本如為術中腫瘤局部回流靜脈血液，可使用適合腹腔鏡引導的靜脈采血裝置采集5 mL血液，血液樣本保存于10 mL注射器內，使用EDTA2K抗凝劑(10×)，術中腫瘤局部回流靜脈血處于高凝狀態，建議加倍使用抗凝劑。(2)使用友芝友公司的CTCs快速染色液，對富集于濾膜上的CTCs行改良瑞氏-吉姆薩染色。(3)評判參數：①細胞核異型性，呈不規則的結節狀、分葉狀等；②核質比>0.8；③細胞直徑(長端)大于15 μm；④核深染且著色不均勻；⑤核膜增厚出現凹陷或皺褶，使核膜呈鋸齒狀；⑥細胞核染色質邊移，或巨大核仁，或異常核分裂。評判標準：①符合4個或4個以上參數判讀為CTC；②滿足條件⑥之外的任意3個條件或單獨滿足條件⑥判讀為疑似CTC；③3個及3個以上的細胞成團且能鑒定為CTC，但因相互連接重疊無法準確判讀為CTC的細胞團判讀為CTM；④3個及3個以上的細胞成團但不足以判定為CTC的細胞團判讀為疑似CTM；⑤不能判斷為血液來源的細胞但同時也不符合上述四種類型的其他細胞判讀為非血液細胞。(4)CD45抗體ICC檢測，以排除形態學特征類似CTCs的白細胞，從而降低CTCs檢測的假陽性率。(5)細胞核染色為藍色(蘇木素)且細胞膜染色為棕黃色(DAB)即CD45陽性，細胞核染色為藍色(蘇木素)且細胞膜周圍無棕黃色即CD45陰性。見圖2。

圖1 Cell SearchTM系統檢測流程

圖2 CTC-Biopsy?系統檢測流程

4.3 CTCs檢測的推薦時間點及時限 目前CRC CTCs術后檢測時間點尚無公認標準，對于術后隨訪，我們推薦根據NCCN結腸癌及直腸癌指南中所提到的隨訪時間，同時進行CTCs的檢測。結合病史及查體，術后前2年，每3～6個月復查1次；3～5年，每6個月復查1次；5年后，根據情況，決定是否需要繼續行CTCs檢測。

5 CTCs的臨床意義

5.1 早期篩查 CTCs在健康人及良性結直腸疾病患者的外周循環中含量極少[25]，這使得CTCs檢測作為CRC早期篩查的方法成為可能。由于CTCs檢測平臺的差異，CTCs在CRC早期篩查中的敏感性亦不相同。基于免疫學原理的CellSearch平臺研究發現，Ⅰ～Ⅳ期CRC患者的CTCs敏感性分別為4.9%、10.5%～20.7%、8.3%～24.1%、18.8%～60.7%[26-27]，總敏感性為10.5%[26]。基于物理原理分篩CTCs的CTC-Biopsy平臺的數據優于CellSearch平臺，其對應的敏感性分別為12.5%，31%、74%與91.7%，總敏感性為52.8%[28]。2018年ASCO會議的一項納入620例受試者的前瞻性臨床研究表明，使用CellMax仿生平臺(CMx)檢出CRC癌前病變的敏感性為76.6%，與結腸鏡的篩查效果(76%～94%)接近；而對于CRC的敏感性高達86.9%，超過糞便潛血試驗(FOBT)的篩查效果(62%～79%)，與結腸鏡檢查的效果相同(75%～93%)[29]。因此，在合理選擇CTCs檢測平臺、控制檢測成本、制定并完善相應檢測指征及判讀標準的前提下，使用CTCs檢測作為CRC早期篩查的方法是合理可行的。

5.2 預后判斷

5.2.1 非轉移性CRC 不論哪種檢測方法，對于CRC而言，外周循環中檢測到CTCs(或CTM)即提示預后不良[30-31]。CTCs作為一種預后因子，可能優于傳統的病理學分期[26,32]。研究表明，對于AJCCⅠ-Ⅲ期的CRC患者，術前外周血CTCs是患者總生存期及無進展生存期強效且獨立的預測因子。與術前外周血中CTCs陰性患者相比，陽性患者(≥1個CTC/7.5 mL血液)的總生存期及無進展生存期均顯著下降[26]。外周循環CTCs數量與預后亦有相關性，術前CTCs數量越多，術后出現遠處轉移的可能性越高[33]。當外周循環CTCs數量達到5個/2 mL血液時，術后1年內發生遠處轉移的概率升高8倍[34]。因此，對于CRC患者，術前外周循環檢測到CTCs可視作腫瘤復發或遠處轉移的高危因素，術后應規律復查，密切隨訪，適當予以更為積極的治療。

5.2.2 轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC) 目前認為，CTCs是惡性腫瘤血行轉移的基礎[35]，因此，在mCRC患者中，外周循環的CTCs數量較CRC患者更多[26,33]，其作為預測因子的標準亦與CRC有所不同。研究表明，不論在基線水平抑或接受輔助治療(包括化療和/或靶向治療)后，當外周循環CTCs≥3個/7.5 mL血液或檢測到CTM時，提示預后不良，相應的mCRC患者的總生存期及無進展生存期顯著下降[36-40]。外周循環CTCs與患者年齡、輔助治療方案、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平及ECOG評分等均是mCRC患者總生存期及無進展生存期的獨立預測因子，聯合應用在提示預后方面具有重要的臨床意義[37,41]。目前，對于CTCs≥3個/7.5 mL的mCRC患者是否需要更改治療方案尚無高級別證據支持，尚待后續研究。

5.3 療效預測 除外CTCs在判斷預后方面的作用，治療過程中，動態監測外周循環CTCs水平，有助于了解患者的治療效果。對于接受根治性手術的CRC患者，術后24 h內CTCs水平顯著下降，提示手術效果良好，腫瘤復發的可能性低[42]。對于接受化療和/或靶向治療的mCRC患者，經過治療后CTCs數量下降，表明治療有效，患者總生存期及無進展生存期顯著延長[38-39]。外周循環中CTCs的數量與疾病的進展呈正相關，治療過程中或術后復查時規范檢測CTCs可幫助判斷疾病的狀態，與影像學檢查及腫瘤標記物(CEA)檢測聯合應用具有更高的臨床指導價值[36,43]。

5.3.1 CTCs檢測與影像學 關于CRC患者，多項研究將CTCs檢測與影像學結果進行相關性分析，以評價CTCs對CRC患者療效評估的意義[38,44]。結果顯示，與影像學檢查相比，在早期診斷[45]、術后隨訪[44,46]、療效評估[38,47]及監測腫瘤復發[48]等方面，CTCs檢測對于疾病的進展均具有更好的預測價值。此外，CTCs檢測的動態變化與影像學結果存在顯著相關性，在時效性方面則優于影像學檢查[33]。尤其對于mCRC[39]，CTCs檢測可先于影像學檢查更早地發現腫瘤轉移的線索。因此，CTCs檢測與影像學檢查相結合可提供更多臨床信息[30]。

5.3.2 CTCs檢測與CEA 血清CEA是CRC診斷及隨訪中最常用的腫瘤標志物，在CRC的診斷及預后評價中具有非常重要的作用。研究表明[41]，CRC患者CTCs檢測結果與血清CEA檢測結果存在高度相關性，且特異性更高。因此，與CEA相比，CTCs檢測可提供更多治療后整體預后評估證據[49]。

6 展 望

CTCs雖然很早就被發現，但由于技術條件的限制，其應用于CRC臨床診療的過程困難重重。而近年，由于CTCs分離檢測技術的發展與成熟，使其在臨床應用中變得切實可行。眾所周知，惡性腫瘤是一種全身性疾病，CTCs在血液循環中的數量、狀態與疾病的早期診斷、腫瘤分期的細化、復發轉移風險的評估及治療效果的判斷等密切相關，尤其對復發、轉移性CRC具有更重要的意義。

但在現階段，CTCs檢測仍面臨一系列亟待解決的問題，如對CTCs亞型的認識仍不充分、對CRC分期指導作用的細化、對隨訪及指導圍術期治療手段選擇意義的量化仍不明確等。

本共識的制定旨在對CTCs檢測在CRC中的應用起到初步的釋疑及指導作用，從而為CRC的臨床診療提供有效、可行的檢測手段。

循環腫瘤細胞檢測在結直腸癌中的應用專家共識(2018)討論專家

(按姓氏筆畫排序)

于文濱 山東大學齊魯醫院

葉穎江 北京大學人民醫院

畢冬松 山東大學齊魯醫院

伍冀湘 首都醫科大學附屬北京同仁醫院

劉宏斌 蘭州軍區總醫院

孫誠誼 貴州醫科大學附屬醫院

孫躍明 南京醫科大學第一附屬醫院(江蘇省人民醫院)

李 非 首都醫科大學宣武醫院

李 勝 山東省醫學科學院

李 勇 廣東省人民醫院

何顯力 空軍軍醫大學唐都醫院

陳穎潔 山東大學第二醫院

鄭民華 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院

宋茂民 首都醫科大學附屬北京天壇醫院

房學東 吉林大學中日聯誼醫院

趙 任 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院

胡三元 山東大學齊魯醫院

胡建昆 四川大學華西醫院

柯重偉 復旦大學附屬上海市第五人民醫院

姜可偉 北京大學人民醫院

高德海 山東省醫學科學院

徐大華 首都醫科大學宣武醫院

黃順榮 廣西壯族自治區人民醫院

蔡開琳 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院

戴 勇 山東大學齊魯醫院

秘書組：王延磊 程志強 張 翔 李 浩 董朔暉 張文杰 劉增林 鄭文博