髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1基因rs9471535單核苷酸多態(tài)性與男性早發(fā)冠心病的相關(guān)性

楊 勇，孟濤疆，馬東星，劉 英，沈志奇，黃 潔，趙 清，王冉冉，楊長(zhǎng)春

近年來(lái)，冠心病(coronary artery disease, CAD)的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)持續(xù)上升，其中男性CAD患者比例明顯高于女性，且均呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢(shì)[1]。目前，臨床上根據(jù)CAD發(fā)病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果將男性CAD發(fā)病年齡≤55歲稱為早發(fā)冠心病(premature coronary artery disease, PCAD)[2]。相較于女性PCAD患者發(fā)病仍受月經(jīng)周期期間體內(nèi)激素水平變化影響，男性PCAD的發(fā)病過(guò)程中遺傳因素發(fā)揮著重要作用，而關(guān)于遺傳機(jī)制方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，是一種進(jìn)展性動(dòng)脈壁增厚的慢性炎性反應(yīng)過(guò)程[3]。而髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)在一系列研究中顯現(xiàn)出其對(duì)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控效力[4-7]。2014年，Golovkin等[8]以俄羅斯人群為研究對(duì)象探討了TREM-1基因以rs9471535為代表的若干SNP位點(diǎn)與CAD發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果顯示其與CAD發(fā)病顯著相關(guān)。但是目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面報(bào)道。本研究旨在探討TREM-1基因rs9471535位點(diǎn)與男性PCAD發(fā)病的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇原武警總醫(yī)院心內(nèi)科2015-08至2017-01收治的男性住院患者(年齡≤55歲)，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診CAD的患者納入PCAD組，選擇冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CTA排除CAD的健康對(duì)照者納入對(duì)照組。CAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：冠狀動(dòng)脈造影顯示3支主要冠狀動(dòng)脈(左前降支、左回旋支及右冠狀動(dòng)脈)中至少有1支狹窄程度≥50%并符合2008年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)頒布的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡18～55歲；(2)北方地區(qū)(出生、成長(zhǎng)并久居于北方地區(qū))漢族人群，且相互間無(wú)血緣關(guān)系；(3)符合冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CTA檢查指征并完成冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CTA檢查；(4)患者知情同意，自愿參加。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)嚴(yán)重肝、腎功能異常或凝血功能異常者；(2)圍術(shù)期有明顯消化道出血，30 d內(nèi)有活動(dòng)性出血病史或?qū)鼓幬锎嬖谶^(guò)敏體質(zhì)及明顯禁忌；(3)對(duì)造影劑過(guò)敏者；(4)入院血常規(guī)檢查血小板計(jì)數(shù)<100×109/L或>300×109/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)<4×109/L或>10×109/L；(5)患腫瘤性疾病且預(yù)期壽命小于3個(gè)月者。收集患者的一般情況及冠心病相關(guān)的臨床資料，包括年齡、冠心病史、糖尿病史、高脂血癥病史、吸煙史。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 DNA提取 本研究提取基因組DNA采用上海捷瑞生物工程有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)。

1.2.2 DNA引物 TREM-1基因rs9471535[C/T]位點(diǎn)信息如下：TTTTAAATTTAAATAAAAAGATTCC[C/T]ACTGCTAAATAAACAAAAAAATAAC；上下游引物見(jiàn)表1；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為244 bp，GC堿基比例為31.97%。

表1 rs9471535單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

注：TREM-1：triggering receptor expressed on myeloid cells-1

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系的組成成分如下：基因組DNA，1 μl；10×buffer，1.5 μl；MgCl2(25 mM)，1.5 μl；DNTP(10 mM)，0.3 μl；引物(10 p)，0.15 μl；Taq酶(5 U/μl)，0.3 μl；H2O，補(bǔ)至15 μl。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃，3 min，變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，變性、退火、延伸35 cycles，再次延伸72 ℃，3 min。

1.2.4 連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR) LDR反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物，3 μl；10×Taq DNA ligase buffer，1 μl；Taq DNA ligase(40 U/μl)，0.125 μl；探針(10 p)，0.01 μl；H2O，補(bǔ)至10 μl。LDR連接條件：94 ℃反應(yīng)30 s；56 ℃，3 min，共30個(gè)循環(huán)。取1 μl的連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入8 μl的加樣緩沖液HiDi(高度去離子甲酰胺)以及2 μl的Marker，混勻后在95 ℃下變性3 min，立即冰水浴，然后加樣到ABI 3730XL測(cè)序儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。最后通過(guò)判讀電泳結(jié)果對(duì)目的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 研究最終收集男性PCAD患者121例，平均(47.47±5.47)歲；對(duì)照組196例，平均(45.77±6.35)歲。PCAD組高血壓病史、糖尿病、高脂血癥及吸煙患者比例均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 PCAD組與對(duì)照組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床資料比較 (n;%)

2.2 基因分型毛細(xì)管電泳峰圖 圖1為ABI 3730XL測(cè)序儀中毛細(xì)管電泳基因分型檢測(cè)結(jié)果：A為T(mén)T基因型，B為CC基因型，C為CT基因型。

圖1 rs9471535位點(diǎn)毛細(xì)管電泳圖

2.3 TREM-1基因rs9471535多態(tài)性分析 研究人群中TREM-1基因rs9471535位點(diǎn)基因型的分布符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，基因型(CC/CT/TT)組間分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.017)，等位基因組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.720，表3)；單因素分析表明，與TT基因型相比，rs9471535位點(diǎn)CC基因型在PCAD組與對(duì)照組間的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；多因素分析結(jié)果顯示，rs9471535位點(diǎn)CC基因型在PCAD組與對(duì)照組間的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.011，表4)。

表3 兩組PCAD患者rs9471535(C/T)SNP基因型和等位基因頻率 (n; %)

表4 TREM-1基因rs9471535多態(tài)性與PCAD相關(guān)性Logistic回歸分析

3 討 論

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM) 是一類表達(dá)于免疫系統(tǒng)髓樣細(xì)胞的免疫球蛋白超家族。在這一免疫球蛋白超家族中，目前研究較多的成員包括TREM-1、TREM-2、TLT-1及TLT-2等。其中，TREM-1是最早于2000年被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的受體蛋白[9]。而編碼人的TREM-1基因位于6p21.1，長(zhǎng)度約為19 kb，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。研究表明，TREM-1通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)[10,11]和NF-κB[12-14]等炎性因子活性，進(jìn)而觸發(fā)和擴(kuò)大炎性反應(yīng)中各種炎性因子級(jí)聯(lián)效應(yīng)，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要的調(diào)節(jié)作用，可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs9471535位點(diǎn)在研究人群中分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，提示本研究所選擇的樣本具有較好的人群代表性。初步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩組間三種基因型(CC/CT/TT)分布明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TREM-1基因rs9471535位點(diǎn)可能與PCAD發(fā)生相關(guān)。經(jīng)Logistic回歸，進(jìn)一步校正兩組間冠心病的一些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素(高血壓、糖尿病、高脂血癥及吸煙)后，結(jié)果仍然顯示該SNP位點(diǎn)CC基因型相較于TT基因型而言，對(duì)PCAD發(fā)生起保護(hù)性作用，也就是說(shuō)，攜帶CC基因型的男性患者出現(xiàn)PCAD的風(fēng)險(xiǎn)相較于TT或TC基因型更低。繼我課題研究組呂強(qiáng)等[16]2017年完成相關(guān)TREM-1基因與冠心病發(fā)病相關(guān)研究后，國(guó)內(nèi)陸嬌等[17]于2018年亦進(jìn)行了TREM-1基因與冠心病發(fā)病的群體遺傳學(xué)報(bào)道。該報(bào)道提示rs9471535位點(diǎn)可能與冠心病發(fā)病相關(guān)，特別是與急性冠脈綜合征(ACS)密切相關(guān)。兩研究在疾病發(fā)病的群體遺傳學(xué)趨勢(shì)上是一致的。上述研究結(jié)果與國(guó)外Golovkin 等[8]報(bào)道的結(jié)果相近，即rs9471535與冠心病發(fā)生相關(guān)。但是，國(guó)外研究認(rèn)為，攜帶CC基因型人群發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增高。研究人群種族各異、基因分型方法不同，以及與所選研究人群主要集中在中國(guó)北方地區(qū)等，可能是造成上述研究結(jié)果間差異的主要原因。

綜上所述，本研究于國(guó)內(nèi)率先就rs9471535位點(diǎn)與男性PCAD發(fā)生的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)CC基因型在研究人群中分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，攜帶CC基因型的人群發(fā)生PCAD的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。另外，本研究為橫斷面研究，僅入選研究期間的男性PCAD患者，且研究對(duì)象相對(duì)較少、樣本量有限，選取的研究人群主要為中國(guó)北方地區(qū)，因而其結(jié)果不能完全代表中國(guó)大陸漢族人群PCAD的全部特點(diǎn)，結(jié)果的外延性受到限制。上述局限性也促使有必要進(jìn)行更大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查分析，從而為男性PCAD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

(致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供的技術(shù)及專業(yè)指導(dǎo))