三七種植前后土壤營養、酶活性與微生物群落結構的變化研究

趙 靜，鄭麗君，張曉東，王連春，萬瓊蓮，王志遠

（1. 玉溪師范學院化學生物與環境學院，云南 玉溪 653100；2. 玉溪市質量技術監督綜合檢測中心，云南 玉溪 653100；3. 德宏師范高等專科學校農學與生物科學學院，云南 芒市 678400）

【研究意義】三七〔Panax notoginseng（Bruk）F.H.Chen〕又名田七，為五加科人參屬植物，具有散瘀止血、消腫定痛的功效，迄今已有400余年的馴化栽培歷史。由于對環境要求的特殊性，目前三七種植90%以上面積集中在云南省［1］，連作障礙的大面積發生嚴重制約著三七種植的可持續發展。土壤理化性質的改變、自毒作用及微生物失衡導致的病害增加是連作障礙發生的主要原因，其中微生物群落失衡是最主要的因子［2-4］。在三七栽培中，隨著連作年限的延長，病害發病率明顯增加［5］。明確三七栽培種土壤理化性質、酶活及微生物群落結構的改變是解決三七重茬問題的關鍵。土壤微生物群落結構組成的動態變化越來越多被用來評估微生態系統的響應，在一定程度上具有反映早期生態系統破壞與恢復程度的功能［6］。根際土壤微生物群落能夠迅速反映環境條件的變化，特別是在作物連作障礙形成的初期對環境的變化最為敏感。

【前人研究進展】董林林等［7］研究了人參根際1、2、3年的真菌組成變化，與森林土相比，人參根際土壤微生物多樣性較高，且隨著種植年限的增加，多樣性增加趨勢下降。譚勇等［8］基于Illumina MiSeq測序平臺分析了三七種植前后土壤及種植3年根際土壤中細菌群落結構的變化，發現種植三七前后土壤細菌群落多樣性指數和豐富度指數的變化規律基本一致。

【本研究切入點】目前尚未見三七根際土壤中隨著種植年限的延長，真菌、細菌結構群落變化的系統報道。【擬解決的關鍵問題】本研究將明確三七重茬土壤中土壤養分及酶活性的變化，結合高通量測序的技術，分析種植年限的延長對三七根際土壤真菌群落、細菌群落影響的相關性，為克服三七連作障礙提供有效的策略。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土樣于2018年采自云南省建水縣三七種植基地。按照五點取樣法采集3年生三七根際土壤，每點采集2株三七的根際土壤混合，周邊未種植三七的土壤（對照）也按五點取樣法取樣混合。土壤取樣深度為0～30 cm，土樣采集后迅速置于冰盒中儲存、備用。

1.2 土壤理化性質測定

土壤全氮的測定采用開氏消煮法，土壤全磷的測定采用碳酸鈉熔融法，土壤全鉀的測定采用氫氧化鈉熔融法，有機質的測定采用油浴加熱K2Cr2O7容量法，有效磷的測定采用碳酸氫鈉法，有效鉀的測定采用乙酸銨提取法，堿解氮的測定采用堿解擴散法，土壤pH值的測定采用pH計。

1.3 土壤酶活性測定

土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸法測定，堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉法測定，多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法測定。

1.4 土壤微生物群落分析

采用MOBIO Power-Soil Kit（MOBIO，美國）提取土壤總DNA，利用通用引物擴增真菌NS1-FUNG通用引物、細菌16SrRNA基因V3-V4通用引物標簽序列。序列擴增、純化、均一化參照Jorge等［9］的方法。

采用Miseq測序平臺測序平臺獲取土壤真菌宏基因組序列，利用QIIME 軟件進行序列分析。數據預處理采用Flash軟件融合雙末端序列，通過barcode區分樣品序列，去除非靶區域序列及嵌合體［10］。采用Sliva將序列進行物種分類，對每個樣本和每個物種單元分類進行序列豐度計算，構建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣。

2 結果與分析

2.1 種植三七對土壤養分的影響

土壤酶活性是衡量土壤質量的一個重要指標［11］。從表1可以看出，與對照相比，隨著三七種植年限的延長，土壤pH值、有機質、全鉀、速效磷、速效鉀含量均表現出明顯上升的趨勢，全氮、全磷、堿解氮含量下降。其中全磷、有機質變化最為顯著，全磷含量為對照土壤的2.7倍，有機質含量為對照土壤的1.2倍。

2.2 種植三七對土壤酶活性的影響

土壤養分是衡量土壤質量的一個重要指標。由表2可知，三七種植3年后土壤養分變化明顯，除堿性磷酸酶活性降幅不大外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均顯著下降，其中土壤脲酶活性、蔗糖酶活性分別降低16%、19.6%，多酚氧化酶活性變化最為顯著，降低30%。

2.3 高通量測序數據處理分析

樣品中真菌及細菌標簽測序的原始數據見表3。使用Usearch去除預處理后序列中的非擴增區域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調用uchime進行鑒定嵌合體；隨后，再將去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行blastn比對，低于閾值的比對結果認為是靶區域外序列，剔除該部分序列后獲得目標序列（Filtered num）。為了便于分析，本研究將Filtered num聚類為OUT，相似度低于97%的序列劃分為一個OUT，每個OUT可視為一個微生物物種。

2.4 種植三七對土壤真菌群落組成的影響

三七種植前后土壤在科水平上檢測分類出占比較高的15類真菌，分別為Tricholomataceae（白蘑科）、Physodermataceae（節壺菌科）、Helotiaceae（柔膜菌科）、Nectriaceae（從赤殼科）、Pneumocystidaceae（肺孢子菌科）、Trichocomaceae（發菌科）、Endogonaceae（內囊霉科）、Mucoraceae（毛霉菌科）、Didymellaceae（黑星菌科）、Botryosphaeriaceae（葡萄座腔菌科）、Hydnodontaceae（齒菌科）、Amphisphaeriaceae（黑盤孢科）、Herpotrichiellaceae（草本菌科）、Alphamycetaceae（粉螨科）、Filobasidiaceae（絲狀擔子菌科）。如圖1所示，兩個土壤樣品在屬水平上檢測分布的真菌屬為臘傘屬、犁頭霉屬、鐮刀菌屬、咖啡銹菌屬、念珠菌屬、褐核盤菌屬等25個屬真菌。三七種植前后土壤樣品中真菌群落結構組成及種群密度具有明顯不同：種植前土壤中主要以Hygrocybe為優勢菌種（55.17%），而種植三七后明顯下降（0.37%）；隨著種植年限的延長，Fusarium（鐮刀菌屬）取代Hygrocybe（潮霉屬）成為優勢菌種，其占比由0.25%上升到8.31%，增加32倍，該屬真菌主要引起三七根腐病。這與Miao等［4］的研究結果相似，鐮刀屬真菌是種植三七后土壤中分離最多的真菌屬，說明隨著種植年限的延長，三七根系土壤中鐮刀菌的數量會發生較大幅度的增加。其次，我們還檢測到犁頭霉屬、駝孢銹菌屬、灰葡萄孢，含量為7.17%、4.85%、3.04%，其中灰葡萄孢可引起三七灰霉病。另外，分析結果也表明隨著種植年限的延長，從屬水平上檢測到的真菌的種類比種植前土壤有所增加，其種群密度也明顯上升（圖1）。另外，本次樣品中共檢測到5種引起三七常見病害的病原真菌，分別為：Fusarium（鐮刀菌屬）、Botrytis（葡萄孢屬）、Alternaria（鏈格孢屬）、Rhizoctonia（立枯絲核菌屬）、Colletotrichum（炭疽菌屬），其種群密度均高于種植前。

表1 三七種植前后土壤理化性質特征Table 1 Soil physico-chemical properties before and after cropping Panax notoginseng

表2 三七種植前后土壤酶活性(mg/g.24h)Table 2 Soil enzyme activities before and after cropping Panax notoginseng

表3 序列與OUT信息Table 3 Sequence and OUT information

2.5 種植三七對土壤細菌群落組成的影響

圖1 三七種植前后土壤中真菌微生物群落組成結構特征Fig. 1 Microbial composition of the fungus before and after cropping Panax notoginseng

三七種植前后土壤在科水平上檢測分類出占比較高的15類細菌，分別為Gemmatimonadaceae（芽單胞菌科）、Methanomassiliicoccaceae（甲烷菌科）、Xanthomonadaceae（黃單胞菌科）、Bradyrhizobiaceae（慢生根瘤菌科）、Comamonadaceae（叢毛單胞菌科）、Thermoanaerobacteraceae（嗜熱厭氧桿菌科）、Rhodocyclaceae（紅環菌科）、Gaiellaceae（尚無譯名）、Chitinophagaceae（噬幾丁質菌科）、Nocardioidaceae（類諾卡氏菌科）、Rhodospirillaceae（紅螺菌科）、Xanthobacteraceae（黃色桿菌科）、Pseudonocardiaceae（假諾卡氏菌科）、Oxalobacteraceae（草酸桿菌科）、Cystobacteraceae（孢囊桿菌科）等。如圖2所示，三七種植前后土壤樣品中主要分布的細菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、嗜酸桿菌屬（Aciditerrimonas）、熒光假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養單胞菌屬（Streptomyces）、紅游動菌屬（hodoplanes）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。通過分析發現，三七種植前后土壤中的細菌群落組成與結構有明顯差異，其中紅游動菌屬在3年生三七根系土壤中（0.95）明顯低于未種植三七土壤（2.28），比值相差2.4倍，這與譚勇等［8］的研究結果相似，一些屬如鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等隨著三七種植年限的延長呈上升趨勢，而一些常報道的生防菌如假單胞菌（Pseudomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）卻隨著三七種植年限的延長呈下降趨勢。

圖2 三七種植前后土壤中細菌微生物群落組成結構特征Fig. 2 Microbial composition of the bacteria before and after cropping Panax notoginseng

2.6 種植三七對土壤微生物群落多樣性的影響

植物在生長發育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養分，而且通過根分泌的方式向根周圍釋放一些無機離子和有機化合物，這些物質的積累會導致土壤微生物群落改變［12-14］。常用的表征微生物α多樣性的指數有香農指數（Shanon diversity index）、辛普森指數（Simpson index）等，香農指數多樣性指數越高說明微生物群落越豐富，辛普森指數越低說明微生物群落越豐富。對三七種植前后土壤樣品進行微生物α多樣性分析，結果（表4）表明，種植三七后土壤中真菌及細菌的Shannon指數上升，而Simposon指數下降，說明土壤中微生物的多樣性隨著種植年限的延長而增加。

表4 三七種植前后土壤微生物α多樣性豐富度Table 4 The αdiversity of the soil microbial organism before and after cropping Panax notoginseng

2.7 種植三七對土壤物種豐度的影響

物種豐度熱圖（Heatmap）是用顏色變化反映群落分布的豐度信息，可以直觀地將群落分布豐度值用定義的顏色深淺表示。同時將樣品以及群落分布信息進行聚類并重新排布，將聚類后的結果顯示在熱圖中，從而可以很好地反映各分類水平上群落分布組成異同。如圖3所示，每一列代表一個樣本，行代表群落結構，顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍則相對豐度越低，其趨勢為藍色＜綠色＜黃色＜紅色。由圖3可知，隨著三七種植年限的延長，土壤中各真菌的物種豐度會有所增加；而細菌卻恰恰相反，隨著三七種植年限的延長，物種豐度則有所下降。

圖3 真菌、細菌物種豐度熱圖Fig. 3 Hertmap of fungus and bacteria

3 討論

3.1 土壤微生物群落結構和多樣性的影響因素

研究表明，土壤真菌群落的豐度與土壤理化指標相關，pH值、有效鉀、土壤總氮均與真菌群落的豐度顯著相關［15-16］。董林林等［7］研究表明，土壤pH與Dothideomycetes和Alatospora的豐度顯著相關，有效鉀含量與Dothideomycetes、Alatospora、Mucorales的豐度顯著相關，土壤總氮含量與Sordariomycetes、Mucorales的豐度顯著相關。本研究中，三七種植前后土壤理化性質也發生了較大變化，主要為pH值上升，全氮、全磷含量明顯下降，有機質含量明顯升高，堿解氮降低而速效磷和速效鉀含量升高，這可能是引起土壤真菌群落變化的因素之一。

另外，根系分泌物也會影響土壤真菌群落變化［17-19］。我們在前期研究中，利用GC-MS從三七重茬土壤中共檢測到29種化感物質，其中對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二異丁酯對三七病原菌（F.oxysporumSchlecht）的生長呈現低促高抑的現象，且當對羥基苯甲酸濃度為5 mmol/L時能促進病菌小孢子的產生［20］。本研究中，3年生三七根系土壤中，Fusarium成為優勢菌種，百分比含量為8.31%，比種植前增加32倍，這與前期結果相符。

3.2 土壤微生物群落結構變化與病害的關系

Xiong等［21］曾報道香草根際土壤微生物多樣性隨著連作年限的延長，真菌群落多樣性增加。本研究中，引起三七病害的主要病原菌Fusarium在連作后增加最為明顯，其次Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的豐度也有所上升，這也可能是三七連作病害高發的主要原因。另外，隨著連作年限的延長，已報道的具有生防功能的細菌Pseudomonas、Streptomyces卻隨著三七種植年限的延長呈下降趨勢，根際群落結構失調，這可能也與病害的發生有關。

4 結論

本研究采用土壤酶活性檢測及土壤理化性質測定方法結合Illumina MiSeq測序平臺采用16S rDNA、18S rDNA分析技術對三七種植前土壤、種植3年根際土壤中的細菌群落多樣性進行分析，結果表明，三七種植3年后土壤養分失調，表現為pH值、全鉀、有機質、速效磷、速效鉀含量上升，而全氮、全磷、堿解氮含量下降；土壤酶活性呈下降趨勢，除堿性磷酸酶活性變化不大之外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均明顯下降；三七種植前后土壤在科水平上檢測分類出占比較高的15類真菌、16類細菌，其中，三七種植前土壤中真菌主要以Hygrocybe為優勢菌種，而3年生三七根系土壤中Fusarium成為優勢菌種，比種植前增加32倍，且引起三七常見病害的Fusarium、Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的種群密度均高于種植前；α多樣性分析及物種豐度熱圖表明，隨著三七種植年限的延長，土壤中各真菌的物種豐度有所增加，而細菌卻恰恰相反，隨著種植年限的延長，物種豐度呈下降趨勢。