紅提葡萄灰霉病病原菌分離及拮抗真菌的篩選鑒定

趙海霞， 馬巖濤， 李 濤

(銀川能源學院 化學與生物工程學院， 寧夏 永寧 750010)

葡萄灰霉病是葡萄的主要病害之一，導致葡萄產量損失較重[1]。目前，葡萄灰霉病的防治方法主要是農業(yè)和化學防治，但這2種方法均存在一定的局限性[2]。采用拮抗微生物進行生物防治，可以有效減少化學農藥的使用，解決其殘留問題，同時延緩病菌產生耐藥性。尤其對已經產生抗藥性的病菌使用拮抗微生物防治，是一項有效治理抗藥性的措施[3]。為此，筆者于2017年從寧夏紅提葡萄發(fā)病的果實中分離出病原菌灰葡萄孢菌，利用其根際表面土壤，采用對峙生長法對紅提葡萄灰霉病病原菌的拮抗菌株進行初步篩選，得到1株拮抗效果較好的拮抗菌，并對其進行菌種鑒定，以期為紅提葡萄灰霉病的生物防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1紅提葡萄灰霉病病果與土樣均采自寧夏銀川市永寧縣小任果業(yè)種植基地6個不同區(qū)域，用無菌塑料袋帶回實驗室。

1.1.2培養(yǎng)基病原菌培養(yǎng)基PDA：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂18 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，pH自然。拮抗菌培養(yǎng)基YPD：酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂18 g，自來水1 000 mL，pH 7.2。拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)基YPD：酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，自來水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3試劑盒與擴增引物病原菌和拮抗菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司。DNA擴增引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1葡萄灰霉病菌的分離紅提葡萄病果表面用10%次氯酸鈉溶液浸泡3 min后，用無菌水沖洗3次，按常規(guī)組織分離切取若干塊，分別接種在培養(yǎng)基PDA上，22℃培養(yǎng)1～2 d后，挑選與灰葡萄孢菌形態(tài)相似的單菌落接到新培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到菌落表現均勻一致為止。純化后的菌株標記，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，22℃培養(yǎng)3 d后置于4℃冰箱。

1.2.2葡萄灰霉病菌拮抗真菌的分離取土樣10 g加入90 mL無菌蒸餾水并充分混勻，制成10-1土壤懸浮液，加無菌水稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度土壤懸浮液，分別取200 μL懸浮液涂布于固體培養(yǎng)基YPD上，每梯度重復3皿，30℃培養(yǎng)12 h，2 d后根據菌落特征挑選單個菌落于液體培養(yǎng)基YPD中，28℃、120 r/min培養(yǎng)過夜。

1.2.3葡萄灰霉病菌拮抗真菌的篩選采用平板對峙生長法，將灰霉病菌在直徑9 cm固體培養(yǎng)基PDA上活化，用直徑5 mm打孔器沿菌落邊緣打孔，將菌餅置于空白PDA平板中央。在距培養(yǎng)皿中心30 mm，四周呈“十”字形點接各拮抗菌液(菌含量108CFU/mL)，重復3皿，設不接種菌液處理為對照。28℃恒溫培養(yǎng)7 d，測定菌株的生長直徑和抑菌圈直徑，并對其形態(tài)學，如生長狀態(tài)、顏色、形狀、表面、粗糙度、光澤、邊緣形態(tài)、透明度等進行初步鑒定。

1.2.4灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長抑制試驗取葡萄灰霉病孢子菌含量106個/mL的懸浮液20 μL，加拮抗菌發(fā)酵液20 μL，以0.5%葡萄糖液作對照，置于無菌潔凈載玻片上，25℃培養(yǎng)8 h后觀察孢子萌發(fā)情況，計算拮抗菌發(fā)酵液對灰霉病孢子萌發(fā)的抑制率；取灰霉病菌孢子懸浮液0.5 mL加入PDA培養(yǎng)基，將直徑5 mm的滅菌濾紙片蘸上發(fā)酵液，以無菌水作對照，25℃培養(yǎng)3 d后測量抑菌圈直徑，計算拮抗菌發(fā)酵液對灰霉病菌絲生長的抑制率[4]。

抑制率=[(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑]×100%

1.2.5病原菌與拮抗菌的鑒定紅提葡萄灰霉病病原菌與拮抗真菌菌株的形態(tài)特征分析參照《真菌鑒定手冊》[5]。采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，病原菌用微生物真菌菌株鑒定的特異引物ITS1(F)：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4(R)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；拮抗真菌用特異性引物ITS1：3′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5′,LR3R:5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3′，分別進行PCR擴增。反應體系：10×Buffer 2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，病原菌DNA 1.0 μL，ITS1(2 μmol/L)0.5 μL/ITS1(2 μmol/L)0.5 μL，ITS4(2 μmol/L)0.5 μL/LR3R(2 μmol/L)0.5 μL，TaqPolymerase 0.2 μL， ddH2O補足至20 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃最后延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并回收純化后，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，獲得的ITS測序結果在NCBI數據庫中進行序列比對。

2結果與分析

2.1病原菌的篩選和鑒定

經分離純化，在紅提葡萄感染灰霉病的果實表面篩選出1株病原菌，標記為JD2016-8。該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長正常，菌絲生長初期為灰白色，貼著培養(yǎng)基生長且速度快，菌絲顏色逐漸加深為灰褐色，氣生菌絲茂盛、質地較疏松，長度較短。后期菌絲長滿盤后菌落表面成粉狀，氣生菌絲頂端有灰褐色的孢子，產孢后期在培養(yǎng)基上出現黑色不規(guī)則的菌核，大小為(2～4)mm×(1～3)mm。菌落沒有色素，背面不變色，但有發(fā)霉的氣味，5 d左右可長滿培養(yǎng)皿。顯微鏡下觀察，病原菌分生孢子梗為灰褐色，有隔膜，頂端膨大且著生大量葡萄穗狀的分生孢子，分生孢子為近圓形或橢圓形單孢，無色或淡色(圖1)。根據《真菌鑒定手冊》[5]，初步確定JD2016-8為灰葡萄孢菌。

注：A為灰葡萄孢菌(生長5 d)，B為灰葡萄孢菌(生長10 d)，C為分生孢子梗，D為分生孢子。

Note: A.B.scinerea(after 5 d culture); B.B.cinerea(after 10 d culture); C. Conidiophore; D. Conidium.

圖1分離菌的菌落形態(tài)及孢子顯微結構

Fig.1 Colonial morphology and spore microstructure of isolated fungi

以病原菌JD2016-8基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到約700 bp的目的條帶(圖2)，并進行回收純化測序。經序列比對，該菌與GenBank中(登錄號：KJ685806.1)已知灰葡萄孢菌的ITS序列相似性達100%。結合形態(tài)特征和ITS序列分析，確定病原菌JD2016-8為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。

注：M為2 kb DNA Maker，1為病原菌。

Note: M. 2 kb DNA Marker; 1.Botrytiscinerea.

圖2病原菌的ITS擴增電泳圖譜

Fig.2 ITS amplification electrophoretogram ofB.cinereapathogenic fungus

2.2拮抗真菌篩選

對采集土壤樣品進行梯度稀釋法分離，共篩選到24株菌株，采用平板對峙生長法對分離菌株進行拮抗性復篩，只有少數菌株對灰霉病菌有抑制作用，其中有1株高效拮抗菌，標記為SW-W8(圖3)，其發(fā)酵濾液抑菌圈直徑達25.5 mm。在復篩過程中，隨培養(yǎng)時間延長，菌株SW-W8對病原菌的拮抗作用幾乎不變。

圖3 SW-W8對紅提葡萄灰霉病菌的抑制作用

Fig.3 Inhibition effect of antagonistic SW-W8 strain againstB.cinerea

2.3拮抗菌SW-W8的抑菌效果

經葡萄灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長抑制試驗，拮抗菌SW-W8對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)的抑制率為100%，對葡萄灰霉病菌絲生長的抑制率為13.17%。

2.4拮抗真菌的鑒定

菌株SW-W8菌落為圓形、奶油色、不透明，表面光滑濕潤，中間隆起，邊緣整齊，不產生可溶性色素(圖4)。通過光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)，初步確定SW-W8為酵母菌，其具體形態(tài)學鑒定特征見表1。

以拮抗菌SW-W8基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到約650 bp的目的條帶(圖5)，并進行回收純化測序。經序列比對，該菌與GenBank中(登錄號：FR819717.1)已知假絲酵母菌的ITS序列相似性達99%。結合形態(tài)特征和ITS序列分析，確定SW-W8為假絲酵母菌(Candidadiversa)。

圖4菌株 SW-W8的菌落形態(tài)

Table 1 Morphological characteristics of antagonistic SW-W8 strain

項目Item特征Characteristics描述Description菌落形態(tài) 菌落質地奶酪狀 Colonial morphology菌落顏色奶油色反光/暗淡反光平滑/粗糙平滑有無疣突有邊緣全緣菌體液體培養(yǎng) 沉淀+ Liquid culture of fungus cell膜醭-渾濁-產氣+菌體細胞形態(tài) 形態(tài)橢圓 Morphology of fungus cell大小(μm)8.1×9.0出芽方式芽殖(一邊出芽,芽數1/2)

注：M為2 kb DNA Maker，1為拮抗菌。

Note: M. 2 kb DNA Marker; 1. Antagonistic SW-W8.

圖5拮抗菌SW-W8的ITS擴增電泳圖譜

Fig.5 ITS amplification electrophoretogram of antagonistic SW-W8 strain

3小結

利用生防菌防治植物真菌病害是當今研究的熱點之一，相較于化學農藥而言，既經濟有效，又綠色環(huán)保。土壤是眾多微生物的聚集地，從中可以篩選出大量有益拮抗菌，經過高溫處理能生存的拮抗菌具有一定的抗逆性[6]。本研究從紅提葡萄病果上分離出1株病原菌JD2016-8，根據ITS序列分析和菌株形態(tài)特征，鑒定為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。以JD2016-8為指示菌，從土壤中篩選到1株作用明顯的拮抗菌SW-W8，鑒定為假絲酵母菌(Candidadiversa)。

目前，在生物防治研究中細菌已是較為常用的生防菌，其中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是較為常用的生防菌[7-11]，但具有拮抗抑菌作用的真菌較少，有待從大自然豐富的微生物寶庫中篩選出更多具有拮抗作用的菌株。拮抗酵母菌SW-W8的發(fā)酵條件、紅提葡萄利用拮抗菌SW-W8的生物保鮮效果，以及對其他植物灰霉病的生物拮抗防治效果未開展試驗，有待進一步研究，為利用拮抗菌進行生物防治奠定基礎。