遵義地區3種野生食用菌的分離與鑒定

孟慶峰, 張 旭, 祝倫偉, 付少彬

(1.遵義醫學院 公共衛生學院,貴州 遵義 563100；2.遵義醫學院 藥學院,貴州 遵義 563100)

食用菌是高等真菌中可供人們食用的大型真菌(又稱蕈菌)[1]。有研究表明，我國發現的野生食用菌已超過2 000種，其中，馴化栽培的種類超過100種，商品化的種類超過60種，而商品化的野生食用菌中常見的有平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、木耳等[2-4]，僅占食用菌的3%。可見，目前我國野生食用菌具有很大開發潛力。貴州生態環境良好、氣候條件適宜，野生食用菌資源是全國最豐富的地區之一。在食用菌的鑒定中，常依據食用菌的形態進行確定，即通過觀察子實體或培養后觀察菌落形態及個體顯微特征，將標本及菌種鑒定到門、綱、目、科、屬、種。但隨著科學技術的發展，有關學者發現，有些食用菌會隨著生長環境的不同而表現出不同的形態學特征。筆者等對采于遵義地區的3種野生食用菌進行傳統的形態描述鑒定，并進行了組織分離和分子生物學鑒定，以準確判斷其品種和系統地位，為開發和利用該野生食用菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌 3種野生食用菌采自貴州省遵義匯川區團澤鎮雞公山,編號分別為X-01，X-02，X-03。

1.1.2 培養基 1) 配制麥芽汁:取50 g麥芽，磨碎，在45℃水浴中0.5 h，然后升溫到70℃,保持1 h，向其加水至400 mL。2) 培養基配制：20%馬鈴薯汁500 mL，麥芽汁100 mL，葡萄糖15 g，維生素B 150 mg，瓊脂20 g，蒸餾水加至1000 mL，pH 5.5左右。

1.1.3 試劑與儀器設備 試驗所用的試劑及儀器設備見表1和表2。

表1 主要試劑

表2 主要儀器設備

1.2 方法

1.2.1 形態學觀察 借助體視顯微鏡對食用菌子實體進行外部形態學觀察，光學顯微鏡對食用菌的孢子、菌絲特征進行觀察并描述。

1.2.2 菌種的分離與培養 組織分離法：在無菌條件下，先用酒精棉球對菇體進行表面消毒，然后手持菌柄，將菌撕成兩半，取手術刀經火焰滅菌、冷卻后，在菌蓋、菌柄交界處挑取一小塊菌肉，移植到PDA培養基上于25℃培養，待菌絲長出，挑取菌絲純化，再置于25℃恒溫培養箱中培養。

孢子釋放法：在無菌條件下，先用酒精棉球對菇體進行表面消毒，然后除去菌柄，將菇直立，菌蓋朝上放于無菌培養皿中過夜，待孢子長出，對其進行分離、純化，再將其放入25℃恒溫培養箱中培養。

1.2.3 分子生物學鑒定 從子實體組織和菌絲中提取DNA，按照真菌基因組DNA提取試劑盒操作，PCR擴增體系見表3，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將成功獲得的PCR產物送北京博友順生物技術有限公司測序；將上述獲得的序列通過NCBI、BLAST，找出與之同源性最大的序列并運用MEGA7建立系統發育樹。PCR反應程序：預變性 94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，20 個循環；延伸72℃ 10 min，4℃ 保存。

表3 PCR反應體系

2 結果與分析

2.1 子實體特征

3種食用菌的子實體見圖1。X-01：子實體呈傘狀。菌蓋呈鐘形至平展，直徑約7 cm，中部稍微凸起，灰褐色，表面干燥，有的邊緣平滑，有的龜裂。菌肉為白色，受傷后變為灰白色；菌褶灰白色，稍密，彎生，不等長。菌柄為圓柱形，長約5 cm，粗約1.2 cm，表面光滑，白色，受傷后變為灰褐色，內部松軟至中空，基部稍膨大。基物為土壤。X-02：子實體呈耳狀。菌蓋呈漏斗形，直徑約為4 cm，中部下凹，邊緣上翹，表皮顏色為黃褐色，表面干燥、有些許鱗片；菌肉為白色，受傷后變為灰色；菌褶為黃白色，致密，長約2 cm，延生，不等長。菌柄較短，約2.5 cm，圓柱形，灰白色，叢生，內部較為中空，基部略微膨大。基物為梨樹。X-03：子實體呈圓筒形。菌蓋近圓錐形，長約7 cm，寬約5 cm，表面有許多凹坑，似羊肚狀，凹坑近圓形或不規則形，顏色淡黃色或黃褐色，交織成網狀；菌柄長約6 cm，粗約5 cm，中空，基部膨大，基物為土壤。

圖1 3種食用菌的子實體

Fig.1 The fruiting bodies of three wild edible fungi

2.2 菌絲及孢子特征

經過反復的分離、純化得到3種野生食用菌菌絲，在培養基上，X-01號菌菌絲為白色、帶有玫紅色，濃密、呈絨毛狀，產生玫紅色的色素，爬壁能力較強，一般7 d菌絲長滿；X-02號菌菌絲為白色、綿毛狀、較為稀疏，不產生色素，爬壁能力弱，一般13 d菌絲爬滿；X-03號菌菌絲為黃色、絨毛狀、濃密，產生黃褐色色素，后期有菌核生成，爬壁能力強，一般4 d菌絲長滿。

由圖2和圖3看出，X-01號食用菌孢子為單個、淺綠色、近球形，大小約為9 μm×9 μm；菌絲粗細較均勻，有分叉，鎖狀聯合。X-02號食用菌孢子為單個、淡綠色、橢圓形，大小約為7 μm×2 μm；菌絲粗細不勻，有分叉，鎖狀聯合。X-03號食用菌子囊近柱形，有8個孢子、單行排列，孢子無色、為橢圓形，每個大小約為5 μm×8.5 μm；菌絲粗細均勻，有隔，無鎖狀聯合。

圖2 3種食用菌的孢子形態特征

Fig.2 Morphological characteristics of spore of three edible fungi spores

圖3 3種食用菌的菌絲形態特征

Fig.3 Morphological characteristics of hyphae of three edible fungi spores

2.3 PCR擴增

從圖4看出， 6條條帶的片段大小均為500～800 bp。

注：從左至右，條帶依次為3條子實體和3條菌絲體。

Note: The band in the following order: Tree fruiting bodies; tree myceliums.

圖43種野生食用菌子實體及其菌絲的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of three species of wild edible fungi and their mycelium

2.4 分子鑒定結果

將測序結果與GeneBank比較，X-01號菌子實體測序結果與晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]的同源性為98%；菌絲與南海海洋真菌(Fusariumsp)的同源性為99%,子實體的序列結果與表性特征一致，最終以子實體的結果為準，系統發育樹見圖5。X-02號菌子實體和菌絲分子鑒定結果均與漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]的同源性為99%，系統發育樹見圖6。X-03號菌子實體結果與柳毒蛾(Leucomacandida)的同源性為77%；菌絲與冠狀蟲霉(Conidioboluscoronatus)的同源性為95%，子實體和菌絲的序列與表型均不符合，所分離的菌株可能是附著在表面的雜菌，而子實體序列可能是PCR產物直接測序其目的片段，最終以表型特征為主進行鑒定。

X-01號食用菌分類地位：真菌界(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina) ，層菌綱(Hymenomycetes) ，傘菌目(Agadcales) ，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌屬(Rhodophyllus)，晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]。

X-02號食用菌分類地位：真菌界(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)，無隔擔子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌屬(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch:Fr.) Ames]。

X-03號食用菌經過表型特征鑒定為羊肚菌屬，分類地位：真菌界 (Eumycota)，子囊菌亞門(Ascomycotina)，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)。

圖5 X-01號菌子實體系統發育樹

Fig.5 The phylogenetic tree of the mycelium system X-01

圖6 X-02號菌子實體系統發育樹

Fig.6 The phylogenetic tree of the mycelium system X-02

3 結論與討論

采用孢子釋放法和組織分離法分離野生食用菌，通過顯微鏡對3種野生食用菌的子實體、菌絲和孢子形態特征進行觀察，分子生物學方法對其子實體和菌絲進行基因組DNA提取、ITS區測序，綜合形態學特征和ITS基因序列，鑒定X-01號為真菌界(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agadcales)，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌屬(Rhodophyllus)，晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]；X-02號為真菌界，擔子菌亞門，無隔擔子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌屬(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]；X-03號為真菌界，子囊菌亞門(Ascomycotina)，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)。

孢子釋放法比組織分離法的效率高，但是與時間、孢子成熟程度關系較大。采用傳統的形態特征對其進行鑒定，方法雖然簡便、快速、直觀，但仍存在很多不足，有些食用菌的形態特征會隨著生長環境的變化而變化，進而不能完全準確地對食用菌進行分類。因此，分子生物學手段廣泛地應用于未知真菌的鑒定，在食用菌分類上取得了成功，如田慧敏等[5]成功確定了赤峰5種未知真菌的分類學地位。然而，雖然結合分子學方法能更快速地確定食用菌的分類學地位，但也有試驗表明，單從分子生物學的結果并不能準確地確定食用菌的類別，如劉曉婷等[6]對1株白樁菇進行鑒定時，在形態學和分子學的結果上出現了很大的差異，綜合考慮后從形態學的角度確定其為白樁菇屬。試驗中X-01、X-03號食用菌的分離鑒定中也出現了此現象。