抗根腫病種質資源的篩選及油菜抗根腫病種質的合成

梁峰豪,郎麗娜，劉亞萍，王 靜，張 鶴，徐愛遐，黃 鎮

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100；2.山東省農業廳種子管理總站，山東 濟南 250000)

根腫病是蕓薹屬根腫菌引起的土傳性真菌病害，專性危害十字花科植物的根部[1]。感病后的植株在其根部形成大小不等的腫瘤，地上葉片萎垂，植株生長緩慢，最終造成產量損失25%左右，嚴重發病區產量損失高達60%[2-3]。若土壤一旦被根腫菌污染，由于休眠孢子存活力較強，將無法種植十字花科的植物，嚴重危害十字花科植物的生產[4]。根腫病始發于地中海和歐洲南部地區[5]，當前在我國安徽、四川、山東、廣東、重慶、北京等省市地區均有發生，隨著農業機械化程度的提高，發病面積逐年急劇增加[6]。根腫菌屬小種分化專性寄生菌，1931年Honig首次證明了該病原菌存在生理小種分化。目前國際上廣為認可的根腫菌生理小種鑒別系統有2個，即Williams 系統和ECD系統[7]。在中國尚沒有研究出適合國內根腫病菌生理小種鑒定的鑒別寄主系統。國內學者研究根腫病菌生理小種通常采用Williams鑒別系統。丁云花、季海雯、費維新等[8-10]曾先后用Williams系統對我國根腫菌進行生理小種鑒定，共鑒定出2、4、5、7、13號5個生理小種，并指出我國目前主要以4號生理小種為主。

甘藍型油菜(BrassicanapusL.) 是世界上種植面積最廣的油料作物，也是我國目前主要種植的油菜類型，具有產量高，抗病蟲、抗逆性強等優點[11]，但是對于甘藍型油菜抗根腫病材料的報道卻很少。一些研究者已經在蘿卜、甘藍、蕪菁、黑芥、白芥等油菜的近緣物種中發現了抗根腫病的種質，并利用遠緣雜交和人工合成的方法，將這些近緣物種的抗性基因導入到甘藍型油菜中，合成了多份抗根腫病的油菜中間材料[12]。但是截至目前極少有合成抗根腫病的甘藍型油菜品種的報道。自20世紀90年代以來，隨著生物技術的發展，發現白菜抗根腫病基因主要來源于歐洲蕪菁，且各抗性基因之間都保持相對獨立[13]。目前，在大白菜中已經發現8個根腫病抗性基因，分別為Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk[14-18]，這些CR基因均表現為顯性單基因遺傳。

由于根腫菌存在較為復雜的生理機制及小種分化，所以篩選種質資源，并將抗性基因轉移，進而開展抗病育種工作是解決根腫病最有效的方法之一[19]。本研究的目的是從收集到的30份十字花科材料中篩選出抗根腫病種質，同時將獲得的抗性種質與感病甘藍型油菜育種骨干親本雜交，將根腫病抗性基因導入到感病的甘藍型油菜中，并對雜種后代進行真假雜種鑒定，旨在為甘藍型油菜根腫病抗性育種提供材料支持。

表1 30份十字花科供試材料及來源Tab.1 The name and origin of the 30 cruciferae varieties

1 材料和方法

1.1 試驗材料

用于種質篩選的供試材料為30份十字花科種質(表1)，包括3份蘿卜、4份白菜、1份甘藍、9份白菜型油菜、10份甘藍型油菜和3份歐洲蕪菁，供試菌種為四川成都4號根腫菌，-20 ℃保存備用。

1.2 菌液制備與接種篩選

本試驗病原菌種是由沈陽農業大學樸鐘云課題組提供的采于四川成都白菜根腫病病根，-20 ℃保存備用。菌液制備參考肖崇剛、郭向華[20]的方法：取50 g根腫粉碎，加蒸餾水攪成勻漿；用8層尼龍網過濾后將濾液500 r/min，離心5 min，取上清液及上層灰色沉淀；再將獲得的上清液及上層灰色沉淀3 000 r/min離心10 min；將獲得的沉淀物利用血球計數器和光學顯微鏡稀釋孢子到1×107個/mL，并調pH值6.2作為原培養液。

將30份供試材料播種于50(5×10)穴盤中，每份材料播10穴，每穴播1粒種子，2次重復。出苗后3 d用注射法對其根部注射5 mL菌液，繼續培養，35 d后統計抗感病株數及抗病等級。根腫病分級標準參考Kuginuki等[21]的標準(表2)。

表2 根腫病發病調查分級標準Tab.2 The grading standard of clubroot resistance

1.3 病情指數統計與數據分析

按下列公式計算出根腫病發病率和發病指數[21]：

抗性分級以病情指數劃分參照李妍等[22]的標準如下：高抗(HR)：病情指數=0；抗病(R)：病情指數<10；中感(MS)：10≤病情指數≤20；感病(S)：20≤病情指數≤50；高感(HS)：病情指數>50。

1.4 雜交授粉與雜種培育

以篩選獲得的抗性材料歐洲蕪菁Debra作父本，感病材料甘藍型油菜作母本，采用花期重復授粉[23]的方法配制雜交組合。在雜交之前，去除母本已經開放的花以及較小的花蕾，剝蕾、去雄。取套袋父本花藥，均勻涂抹于母本柱頭上，授粉后套袋、掛牌。第1次授粉3 d后，重復授粉1次。種莢成熟后，采收、脫粒。

為提高雜種成活率，采用組培方法培養雜種苗。將獲得的雜種70%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗4～5次，接種于MS培養基上，組培箱培養，培養條件為：溫度25 ℃，光周期16 h/8 h，光強12 000 lx。15 d后雜種苗根系粗壯進行練苗2 d，之后移苗至基質培養，常規管理。

1.5 真假雜種植株鑒定

1.5.1 DNA提取及PCR擴增 采用改良CTAB法[24]提取篩選的抗性種質材料及遠緣雜交獲得對的雜種植株葉片DNA，并純化。PCR反應的試劑購于康為世紀生物科技有限公司。

PCR反應體系為50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL，上游引物和下游引物(10 U)各 2 μL，100 ng/μL 的DNA模板1 μL，ddH2O 補齊至50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，(TM-2)℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。

1.5.2 SSR分子標記 從http://ukcrop.net/perl/ace/search/BrassicaDB與http:www.brassica.info/ssr/SSRinfo. htm 搜索、選取100對SSR引物(Ra、Na、BN與BRMS-系列)用于雜種鑒定。

以上所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 供試十字花科材料抗病性差異分析

對30份供試材料出苗7 d后進行人工接種鑒定，結果表明，不同抗性水平材料之間的發病率和發病指數均具有極顯著性差異(表3、圖1)。最終鑒定結果為：這些材料的發病率為0～100.00%，平均發病率為69.13%；病情指數為0～86.02，平均發病指數為51.45。按照抗病分級標準，將病情指數為10(圖1，黑色虛線)以下的劃為抗病品種。其中有7份材料的病情指數為0，為抗病種質，分別是3份白菜：春蕾、春寶、根抗518；1份甘藍：文甘；3份歐洲蕪菁：斯露加、德白瑞、米藍白，占供試材料的23.33%。其他供試材料表現不同程度的感?。?份表現為中感、2份表現為感病、19份表現為高感，分別占供試材料的6.67%，6.67%，63.33%。其中19份油菜材料全部表現高感，而所得的7份抗性材料均來源于其他十字花科材料。

表3 30份供試材料抗性水平分析Tab.3 Resistance difference and significance of 30 rape varieties

注：表中大寫字母代表1%水平的顯著性差異。

Note: Uppercase letters represent significant in 1% respectively.

圖中大寫字母代表1%水平的顯著性差異。Uppercase letters represent significant in 1% respectively.

2.2 供試材料歐式距離連鎖聚類分析

對30份供試材料的病情指數利用SPSS軟件歐式系統聚類分析法進行連鎖聚類分析，結果顯示(圖2)：當連鎖距離為5時，可以將30份供試材料對根腫病的抗性歸為抗病、中感、感病、高感4個類群。其中，在連鎖距離為0.97處將抗病材料斯露加、德白瑞、米藍白、春蕾、春寶、根抗518、文甘7份材料聚為一類；2份中感和2份感病材料LB-A、LB-B、LB-C和春旺在連鎖距離為2.87處聚為一類；在連鎖距離為2.13處，將19份高感油菜聚為一類。這與病情指數分析結果相符合。

2.3 供試十字花科材料發病率與病情指數相關性分析

對30份供試材料進行發病率與病情指數的相關性分析(圖3)：不同材料的病情指數隨著發病率的增加而增加，兩者之間具有顯著相關性(P<0.05)，其相關系數r=0.980，決定系數為R2=0.960 7，一元線性回歸方程為y=78.186x-2.095 9。由圖3可以看出，19個高感油菜品種(黑色方框內)的發病率達到100%，病情指數均在60以上；虛線三角形框中2份感病材料病情指數為20～40，發病率均高于40%；7份高抗材料集中于原點處；其余為中感材料。

圖2 30份供試材料歐式距離系統連鎖聚類圖Fig.2 Cluster plans chain with Euclidean distance of 30 rape varieties

圖3 30份供試材料發病率與病情指數關系Fig.3 Relations between disease index and disease incidence of 30 rape varieties

2.4 遠緣雜交真假雜種鑒定

2.4.1 F1雜種形態表征及抗性鑒定 雜交組合徐09×Debra經重復授粉的方式，對7個柱頭進行授粉，最終獲得2個角果3粒F1雜種種子。將獲得的3株F1雜種播于基質中后，對F1雜種及雙親的葉形、葉色、葉緣等形態學特征進行比較(圖4)：經過初步鑒定，F1雜種葉色濃綠，葉片肥厚且無明顯缺刻，葉緣刺毛較少，葉型修長呈橢圓形。母本為圓葉，無明顯缺刻，父本有明顯缺刻，葉片整體性狀表現介于兩親本之間且偏向于母本。

圖4 雜種F1真假鑒定Fig.4 F1 identification of hybrid authenticity

將獲得的F1雜種用P4生理小種菌液進行抗性鑒定。通過接種鑒定結果表明，接種后的F1雜種無發病癥狀，這說明獲得的F1雜種為真雜種。

2.4.2 F1雜種SSR分子標記鑒定 用100對SSR引物去掃描遠緣雜種F1及雙親，進行多態性分析。若雜種表現父本DNA帶型或同時表現父母本DNA帶型的為真雜種，僅出現母本DNA帶型的為假雜種。

鑒定結果最終篩選出15對SSR引物在F1雜種及雙親間具有較好的擴增多態性(表4)，多態性引物占總引物的15%。由電泳圖(圖5)可以看到，3個雜種的帶型均同時表現父母本帶型，因此，可以確定此雜交組合所有F1雜種均為真雜種。

表4 多態性引物信息Tab.4 Polymorphic primer information

圖5 引物BRAS063對徐09×德白瑞雜交組合擴增DNA電泳Fig.5 Primer BRAS063 amplification DNA electrophoresis of Xu 09×Debra

3 討論與結論

陜西省是我國油菜主產區之一，其根腫病發病已呈逐年加重趨勢，嚴重制約著油菜產量、品質及生產機械化的推廣[25]。我國對根腫病的研究起步較晚，目前主要通過輪作、藥劑防治、生物防治以及篩選抗病品種方法來防治該病害。王保通等[26]利用生物制劑解淀粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Ba168對甘藍苗期根腫病的發生進行了研究，其防治效果約為80%。國外對根腫病的研究較多，尤其在日本、加拿大和許多歐洲國家。日本研究者曾在2000年發現十字花科作物的根部內生菌(Endophytie fungi)Heteroconiumchaetospica能夠使根瘤減少52%～97%，有效防治根腫病的發生；同時，H.chaetospira可以降低輪枝菌引起的黃化病[27]。

在進行人工抗性鑒定接種的過程中，研究者已經發明許多接種方法，如：插入法、沾根法、注射法、菌土法等等，但所有方法最終目的均是使栽培土中含有根腫菌，為根腫病發病提供條件。本研究采用的是使用較多、操作簡便的注射法[28]，用4號生理小種菌對搜集的30份十字花科材料進行抗性篩選，其中19份高感材料均為油菜，其余十字花科材料分別表現不同抗性，平均發病率為69.13%。春蕾、春寶、根抗518、文甘、Siloga、Debra、Milan White共7份為高抗種質資源，其中，文甘這份高抗根腫病的甘藍材料，是目前報道的為數不多的甘藍抗根腫病資源，為根腫病抗性機理研究及油菜抗根腫病新品種的選育提供了材料基礎。

由于甘藍型油菜中缺乏抗根腫病的資源，因此，急需利用遠緣雜交技術從其近緣物種中導入根腫病的抗性基因。于是本研究以甘藍型油菜育種骨干親本徐09為母本，以抗病歐洲蕪菁Debra為父本，通過遠緣雜交結合常規育種獲得雜種F1。Debra具有很好的抗性，它不僅能夠抗國外根腫菌P5生理小種，還能夠抗中國的P4生理小種，而且具有多個抗性位點，是抗性基因的良好來源。因此，本研究選擇了Debra作為遠緣雜交的抗性基因的供體親本。由于遠緣雜交容易出現假雜種，因此，有必要對其后代材料進行真假雜種鑒定，為了準確的判斷F1雜種的真假，采用形態學鑒定、SSR分子標記鑒定及抗性鑒定3種方法對F1雜種苗進行真假雜種鑒定，獲得了3株F1真雜種。這3份材料可以再通過回交育種，作為抗根腫病過渡“橋梁材料”用于后續的研究。