基因敲減SOX4對口腔鱗癌細胞體外生長的影響*

劉 奕，周 昊，費 偉Δ

1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 口腔科(成都 610072) 2.電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院 口腔科(成都 610072)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的3%。每年全球有50萬新發病例，而其中只有50%的患者生存率大于5 年，由于其發生機制尚未明確，臨床仍很難把握其發生、發展和預后[1-4]。SOX(SRY-related high-mobility-group box)基因是一類重要的轉錄調控因子，其功能涉及多種早期胚胎發育過程[5-6]。SOX4屬于SOX C亞族，表達于細胞核內，SOX4基因的突變、缺失或過表達可導致發育異?；蛳忍煨约膊?，也與腫瘤的形成和發展密切相關。課題組前期研究采用LC-MS/MS技術分別從口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)，OLP-OSCC和OSCC的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)樣本中鑒定出了轉錄調控蛋白SOX4，并對其表達進行了初步的驗證，結果發現相比OLP樣本，SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中表達升高，在口腔鱗癌細胞UM1中表達也升高，在SOX4基因敲減后，UM1細胞中SOX4表達降低。本研究擬以前期研究為基礎，實現SOX4基因敲減，并采用細胞計數法、MTT法、細胞劃痕實驗和細胞侵襲實驗探討轉染后的口腔鱗癌細胞UM1體外生長的變化，從而為進一步研究SOX4的生物學功能提供線索。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 舌鱗狀細胞癌細胞系(UM1)由中山大學光華口腔醫學院陶謙教授惠贈；正常人口腔角質形成細胞 (normal human oral keratinocytes, NHOK)購于上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 人角質形成細胞生長補充劑 和LipofectamineTM3000試劑(Invitrogen公司，美國)，雙鏈SOX4 siRNA (sc-38412)和非特異性對照siRNA(Santa Cruz Biotech公司，美國)，Vi-cell 細胞計數儀 (Beckman Coulter公司，美國)，四甲基偶氮唑藍(MTT, 5 mg/mL)(Sigma-Aldrich公司，美國)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) (Sigma公司，美國)，Synergy HT多功能微孔板酶標儀(BioTek Instruments公司，美國)，HEMA 3染色試劑盒(Thermo Fisher Scientifi公司，美國)，MedCalc軟件 (MedCalc Software公司，比利時)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 實驗組：轉染針對SOX4設計的特異性siRNA的UM1細胞(即 siSOX4細胞，n=5)。對照組：轉染非特異性siRNA的siCTRL 細胞(陰性對照，n=5)；空白對照組(未處理的UM1，n=5)。

1.2.2 細胞培養 NHOK細胞在EpiLife培養基+人角質形成細胞生長補充劑中培養，UM1在DMEM (dulbecco's modified eagle medium)+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+青霉素(100 U/mL)+鏈霉素(100 U/mL)中培養。培養條件為37 ℃、5%CO2培養箱，細胞90%～95%匯合后經0.25%胰蛋白酶消化傳代。參照LipofectamineTM3000試劑說明書指示：取對數生長期UM1細胞，調整細胞濃度為2×105/mL接種至六孔培養板過夜，培養。取雙鏈SOX4 siRNA (sc-38412)和非特異性對照siRNA分別與稀釋后的轉染試劑混合，加入培養基孵育，過夜，更換新鮮的生長培養基，繼續培養48 h。Western blotting檢測結果顯示：UM1細胞轉染前，SOX4蛋白在UM1細胞中的表達明顯高于NHOK細胞，UM1細胞被成功轉染siSOX4后，siSOX4在UM1細胞中的表達明顯低于對照組siCTRL在UM1中的表達。

1.2.3 細胞計數法檢測細胞生長情況 分別從培養皿中收集實驗組siSOX4細胞和對照組細胞，0.25%胰蛋白酶處理，制備單細胞混懸液，將細胞以每孔1×105濃度接種于12孔板中孵育，分別在24、48、72 h收集細胞并重懸于500 μL培養液，Vi-cell 細胞計數儀計數。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖水平 siSOX4 細胞無血清饑餓培養24 h，以每孔4 000個細胞/100 μL培養液接種于96孔板中，置于37 ℃培養。在每個觀察時間點，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃繼續孵育4 h，終止培養，棄孔內上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在Synergy HT多功能微孔板酶標儀上490 nm波長檢測各孔吸收值。

1.2.5 細胞劃痕實驗 該實驗用于評估SOX4敲減后UM1細胞的遷移能力。6孔板接種細胞之前先用marker筆在背面畫橫線標記，每孔劃4條線，將濃度為5×105的細胞消化后接種于6孔板，數量以貼壁后鋪滿板底為宜。細胞鋪滿板底后，用1 mL槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致，吸去細胞培養液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產生的細胞碎片。加入無血清培養基，拍照記錄。將培養板放入培養箱培養，8 d后取出拍照，使用NIH Image J 軟件分析實驗結果。

1.2.6 細胞侵襲實驗 該實驗用于評估SOX4敲減后UM1細胞的侵襲能力。UM1/siRNA細胞無血清饑餓培養24 h，收集消化細胞，重懸于100 μL含0.1%FBS的DEME培養液中，調整細胞濃度為5×104加入上室，下室加入500 μL含10%FBS的DEME培養基，培養24 h后棉簽輕拭小室內的Matrigel和細胞，用HEMA 3染色試劑盒固定染色穿過膜的細胞，顯微鏡下隨機取4個高倍視野并照相，記錄穿膜細胞數。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 SOX4基因敲減后對UM1細胞生長和增殖的影響

在不同時間點(24、48、72 h)使用細胞計數法和MTT法分別檢測轉染siSOX4后UM1細胞的生長和增殖能力，結果顯示，與siCTRL對照組相比，SOX4基因敲減后，UM1細胞在48、72 h的生長和增殖能力明顯下降，差異具有統計學意義(F=41.770，P<0.01)(圖1)。

圖1 SOX4基因敲減后對UM1細胞生長和增殖的影響注：A ：細胞計數法，與對照組相比較，**P<0.01；B：MTT法，與對照組相比較，**P<0.01

2.2 SOX4基因敲減后對UM1細胞遷移能力的影響

細胞培養8 h后，與siCTRL對照組比較，實驗組siSOX4細胞處理后，培養板中細胞空白區域更寬，證明SOX4基因敲減后，UM1細胞的遷移能力下降，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖2)。

2.3 SOX4基因敲減后對UM1細胞侵襲能力的影響

與對照組比較，siSOX4實驗組過膜細胞數量減少68%(P<0.01)，證明SOX4基因敲減后，UM1細胞的侵襲能力下降，差異具有統計學意義(t=16.253,P<0.01)(圖3)。

圖3 SOX4基因敲減后對UM1細胞侵襲能力的影響 注：A ：細胞侵襲實驗結果圖，Scale bar 100 μm；B： 細胞侵襲實驗結果灰度值分析，與對照組比較，**P<0.01

3 討論

SOX4基因在不同類型腫瘤中的具體作用機制研究未得到統一結論，作為轉錄因子，SOX4在基因表達復雜的調節網絡中，其功能也許不是單一的，腫瘤的類別、分級以及SOX4蛋白與其他調節蛋白的相互作用等因素共同決定著該基因在腫瘤中的確切作用[7]。Yoon 等[8]研究者發現相較，周圍正常黏膜組織，SOX4在OSCC組織中的表達明顯上調，且促進了腫瘤細胞的存活能力，增強其對放化療藥物的抵抗能力。但是，有研究[9]發現SOX4在某些腫瘤的發生發展過程中起到抑制作用，這可能與SOX4影響p53活化而引起DNA損傷有關。有研究[10]發現，在組織學分級較好，及TMN分期早期的原發性膽囊癌中，SOX4表達升高。

SOX4 mRNA在人類多種腫瘤中是最為常見的一種上調基因，已被確認為是64種腫瘤標志基因中的一種。近年來對SOX4基因的研究逐步從其生理功能轉向了在疾病中的作用分析，研究[7]認為SOX4在腫瘤發生發展中的機制有以下幾種：1) 對細胞信號通路的調節；SOX4在Wnt、Hedgehog、Notch通路中對細胞的信號傳導起到復雜的調節作用。2)對細胞凋亡的調控：在前列腺癌細胞中抑制SOX4基因的表達后導致其下游靶基因p53正向細胞凋亡調控因子水平降低，間接抑制腫瘤細胞凋亡；沉默SOX4基因的表達后可導致腫瘤細胞中NF-κB的激活因子Bcl10水平降低，凋亡抑制因子表達丟失，腫瘤凋亡增加。3)對miRNA的表達調控：在子宮內膜癌患者，SOX4的上游調控基因miRNA-129-2的過度甲基化而使其功能難以發揮，從而使SOX4過表達。4)對細胞增殖轉移及分化的調控：SOX4可通過上調各類生長因子受體的表達而刺激細胞的增殖。到目前為止，對SOX4基因在不同類型腫瘤中的具體作用機制研究未得到統一的結論，作為轉錄因子，在基因表達復雜的調節網絡中，其功能也許不是單一的，腫瘤的類別、分級以及SOX4蛋白與其他調節蛋白的相互作用等因素共同決定著該基因在腫瘤中的確切作用。

課題組在SOX4的表達驗證前期實驗中發現SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中較OLP樣本表達升高，在口腔鱗癌細胞UM1中SOX4的表達也升高，在SOX4基因敲減后，UM1細胞中SOX4表達降低。在前期研究基礎上，課題組繼續深入研究SOX4基因，結果顯示在UM1細胞中SOX4基因敲減后，UM1細胞的生長、增殖能力，以及細胞遷移和侵襲能力均下降。課題組的研究結果均提示SOX4蛋白在OLP向口腔鱗癌轉變的過程中可能具有促進其發生發展的作用。此外，課題組正在進一步研究SOX4基因敲減后，在OLP癌變過程中，SOX4對部分炎癥相關腫瘤啟動子信號通路的影響，以期能通過初步了解OLP癌變的機制而進一步探索口腔黏膜慢性炎癥轉化為口腔鱗癌的內在機制。