TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ在特應性皮炎小鼠模型中的表達及意義*

張麗霞，王 倩，趙 蓓，盧 葳，段西凌

四川省醫學科學院·四川省人民醫院 皮膚性病研究所(成都 610072)

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)發病機制復雜，其中皮膚屏障功能障礙及多種致病微生物定植是AD患者發病及加重的重要因素。Toll樣受體2(TLR2)可識別金黃色葡萄球菌的肽聚糖成分，通過作用于MyD88-NF-κB信號途徑在引起天然免疫反應同時觸發適應性免疫，誘發AD加重[1]。近年研究[2]表明，胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin ,TSLP)在啟動Th2驅動的適應性免疫起總開關和主調節器的作用。本研究團隊在前期的課題研究中也給與了證實[3]。有研究[4]稱,在體外培養的人角膜上皮細胞中, 外源性致病原與上皮細胞的Toll樣受體(toll like receptors ,TLR)結合后，可以誘導上皮細胞中TSLP的表達增加,進而促進趨化因子受體和各種黏附分子的表達增加。這一結果提示,上皮細胞分泌的TLR可通過TSLP的作用,在上皮細胞介導的固有免疫和適應性免疫間起中介作用。IL-4為TH2型細胞分泌，IFN-γ主要由TH1型細胞分泌，為常用的檢查TH免疫失衡指標。因此，本研究擬通過檢測TLR2、TSLP、IL-4和IFN-γ在AD小鼠模型中的表達，對TLR2、TSLP在AD免疫失衡發病機制中的關系進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑及器材

將32只6～8周SPF級雌性純系BALB/c小鼠(四川省人民醫院實驗動物中心)，按照隨機數字表法分為對照組和實驗組,每組16只。2,4-二硝基氟苯(DNFB)(美國Sigma公司)，小鼠IL-4、IFN-γELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)，小鼠TSLP、TLR2 ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)。兔抗鼠TSLP、TLR2多克隆抗體(美國Prosci公司)，免疫組化染色試劑盒(SP-9001) (北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB顯色試劑、0.01M檸檬酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、多聚賴氨酸(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD模型建立方法 參考張麗霞[3]、Wu G等[5]采用的2,4-二硝基氟苯接觸致敏法建立AD小鼠模型。

1.2.2 血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ濃度檢測 小鼠模型建立成功后，摘除右側眼球取血，常溫靜置30 min后,以離心轉速3 000 r/min，離心半徑10 cm，高速離心15 min后，采用ELISA法測定血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ濃度。

1.2.3 組織學方法 取小鼠皮損組織，常規固定石蠟包埋、切片，進行免疫組化染色。光鏡下，通過Image-proplus6.0軟件分析TLR2、TSLP染色陽性細胞的平均灰度。同時做病理切片，觀察組織病理改變，確認小鼠AD模型建模成功。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠致敏部位皮損及皮膚病理變化

實驗組小鼠皮膚可見典型濕疹樣改變：邊界不清紅斑、丘疹、點狀結痂及苔蘚樣變等。實驗組病理切片提示角化過度，程度不同棘層肥厚，細胞水腫，細胞間橋拉長，真皮淺層可見以淋巴細胞為主的慢性炎細胞浸潤。實驗組皮損及鏡下病理表現均符合AD慢性期表現，提示AD小鼠動物模型建模成功。

2.2 小鼠AD動物模型皮損免疫組化結果

TLR2的陽性表達為棕黃色染色，主要位于細胞膜及胞漿，基底層及棘細胞層廣泛表達。實驗組平均光密度值(136.591±15.621)明顯高于對照組(13.542±3.865)(圖1), 差異有統計學意義(t= 4.551，P<0.05)。

圖1 TLR2在正常小鼠及AD模型組皮損處的免疫組化表達

注：圖A,B為正常對照(A×100，B×400)；圖C,D為實驗組(C×100，D×400)；TLR2的陽性表達為棕黃色染色，主要位于細胞膜及胞漿

TSLP陽性表達也為棕黃色染色，主要位于胞核、胞漿及胞膜少量著色。實驗組陽性表達明顯高于對照組(圖2)。實驗組及對照組平均光密度值分別為(74.306±17.898)、(46.093±3.347)，差異有統計學意義(t=15.213，P<0.05)。

圖2 TSLP在正常小鼠及AD模型組皮損處的的免疫組化表達

注：圖A,B為正常對照(A×100，B×400)；圖C,D為實驗組(C×100，D×400)；TSLP陽性表達也為棕黃色染色，主要位于胞核、胞漿及胞膜少量著色

2.3 兩組AD小鼠血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ表達水平比較

AD小鼠血清TLR2(142.896±11.934)、TSLP(213.621±34.666)、IL-4(97.831±15.882)、IFN-γ(70.999±9.604)的表達水平均明顯高于對照組血清TLR2(14.302±3.548)、TSLP(151.997±22.328)、IL-4(60.560±9.286)、IFN-γ(51.224±4.534)，差異均有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ在AD動物模型實驗組和對照組血清的表達

2.4 實驗組TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ血清表達水平的相關性分析

實驗組小鼠血清中TLR2表達水平與TSLP、IL-4表達水平呈正相關(R=0.854，R=0.845,P=0.003);TSLP、IL-4表達水平呈正相關(R=0.997,P=0.005),而TSLP、TLR2均與IFN-γ表達水平呈負相關(R=-0.756，R=-0.570，P=0.002)(圖3)。

圖3 實驗組小鼠TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ血清表達水平相關性分析

3 討論

AD是一種常見的復發性、瘙癢性、炎癥性皮膚病,嚴重影響著患者的生活質量。AD發病機制復雜。其中皮膚屏障功能障礙伴發微生物定植是AD患者發病及加重的重要因素。TLR是識別微生物特別是細菌及其組分的識別受體之一，通過識別微生物病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引起機體對于致病原的免疫應答。Forbes-Blom等[6]研究發現，小鼠皮膚角質形成細胞表面的TLR2能與金黃色葡萄球菌超抗原結合，增強其針對變應原初始暴露產生的Th2型免疫反應，并導致連續變應原暴露后誘導的Th2細胞數量明顯增加。被激活后的TLRs通過細胞內的MyD88信號通路,增強炎癥細胞的免疫應答作用,同時分泌各種細胞免疫因子,趨化中性粒細胞,巨噬細胞等免疫細胞向感染區域移動,殺滅致病微生物。TSLP就是上皮細胞產生的參與這種信號傳導的細胞因子，并促進機體向TH2型適應性免疫分化[7-8]。

TSLP為IL-7的類似物。主要表達在人類的上皮細胞,皮膚角質形成細胞以及支氣管平滑肌細胞,主要通過激活樹突狀細胞(dendritic cells，DC)發揮免疫效應。其主要通過3個途徑發揮作用：1)TSLP通過上調效應靶細胞表面TLR及其相關配體,促進DC成熟,提高其抗原提呈能力以及致炎作用[9]。2)TSLP還可以誘導DC表達各種趨化黏附分子,促進DC向感染部位的黏附和歸巢。3)TSLP還可以促進初始T細胞成熟，提高其轉化為效應T細胞的轉化率[10]。因此TSLP被譽為炎癥反應的“總開關”。國外研究[11]表明，正常組小鼠上皮細胞TSLP不表達，而在過敏組TSLP表達較正常組明顯增加。本研究團隊在前期的課題研究[3]中發現，AD小鼠動物模型建立后TSLP在皮損及血清表達水平明顯增高。TSLP、IL-4及IgE相關性分析發現，其間存在正相關性，相反TSLP與IFN-γ之間存在負相關性。其中IL-4為TH2型細胞分泌，IFN-γ主要由TH1型細胞分泌，初步證實TSLP參與了AD的進展、持續和慢性化發病機制。

研究[4]報道:在體外培養的人角膜上皮細胞中, 外源性致病原與上皮細胞的TLR結合后，可以誘導上皮細胞中TSLP的表達增加,進而促進趨化因子受體和各種黏附分子的表達增加。這一結果提示我們,上皮細胞分泌的TLR可以通過TSLP的作用,在上皮細胞介導的固有免疫和適應性免疫間起中介作用。

基于以上提示，我們用免疫組化方法及ELISA檢測TLR2及TSLP在AD小鼠模型中的表達，結果顯示TLR2的陽性表達物質主要位于細胞膜及胞漿，基底層及棘細胞層廣泛表達，實驗組表達水平明顯高于對照組；TSLP陽性表達物質主要位于胞核，胞漿及胞膜少量著色。實驗組著色密度明顯高于對照組。血清中TLR2及TSLP水平均高于對照組，TLR2表達水平與TSLP呈正相關，且TLR2與IL-4、IFN-γ表達水平相關性與TSLP一致；提示TLR2有可能通過TSLP作用上調TH2型細胞分泌，下調TH1型細胞分泌，引起TH免疫失衡，誘發AD加重。

分析其可能的機理，受外界微生物刺激后，TLR2過度表達,外源性致病原與TLR2胞外段特異性識別,受體胞內段發生變構,從而激活Myd88通路蛋白,通過激活信號轉導網絡途徑,最終激活NF-κB,繼而使上皮細胞分泌TSLP增加, TSLP激活后促進DC的成熟誘導效應T細胞的趨化遷移,細胞炎癥因子分泌增加,進而引起Th2免疫失衡，誘發致敏，從而在上皮細胞介導的固有免疫和適應性免疫間起中介作用。

綜上所述， TLR2有可能通過識別與AD相關的外源性致敏原,誘導上皮細胞分泌TSLP,進而啟動Th2的超敏反應。那么我們推測在臨床癥狀控制后，其病理生理低水平維持時間內，TLR2及TSLP表達水平高低有可能決定Th1與Th2平衡是否再次被打破，繼而誘發AD復發。因此，TSLP有可能成為預測停藥后是否短期復發的有效指標，有待于今后研究進一步證實。