TCP抑制LSD1對人腎癌786-O細胞增殖和凋亡的影響

王戰士， 楊小榮，任黎剛，張心男，孫 庭

(1.浙江省立同德醫院 泌尿外科， 浙江 杭州 310012；2.南昌大學第一附屬醫院 泌尿外科，江西 南昌330006)

腎癌(renal carcinoma)是泌尿系統常見的惡性腫瘤，其主要病理類型為腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，發病率約占腎癌的85%[1-2]。目前腎癌的主要治療方法是外科手術切除，但轉移性腎癌預后較差，且對放化療等治療不敏感，5年存活率低于5%[3]。分子靶向藥物(如舒尼替尼等)已廣泛用于晚期轉移性腎透明細胞癌，然而藥物的不良反應及高昂醫療費用限制了其臨床應用。表觀遺傳調節異常是腫瘤發生(包括ccRCC)的重要機制[4]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1, LSD1)又稱KDM1或AOF2，是第一個被發現的賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶，屬于黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性的H3K4特異性去甲基胺氧化酶家族[5]，與許多腫瘤的發生、發展密切相關[6]。課題組前期研究發現LSD1在腎透明細胞癌組織中高表達，本文以LSD1為靶點，觀察其特異性抑制劑反苯環丙胺(tranylcypromine，TCP)對人腎癌786-O細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 TCP購自英國ACROS公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司，PCR逆轉錄試劑盒購自Takara公司，MTT、RPMI 1640培養液和胎牛血清購自北京索萊寶科技有限公司。酶標儀購自奧地利Anthos公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞株及細胞培養 人腎癌786-O細胞株購自中國科學院上海生命科學院細胞所，接種于含10 %胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養液，培養條件為37 ℃、5 %CO2，將細胞培養至對數生長期時進行研究。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 將對數生長期的786-O細胞接種于 96 孔培養板，每孔200 μL，細胞密度為2×104個/mL。培養24 h后，吸掉細胞培養液，實驗組分別加入不同濃度 TCP，每孔200 μL。空白對照組加入相同體積的培養液，陰性對照組加相同體積的1 ‰DMSO (PBS稀釋)，每組設6個復孔，分別培養24、48、72 h后加入5 mg/mL MTT溶液 20 μL，繼續培養4 h后用移液器吸凈孔內液體，再加入DMSO 150 μL，水平搖床上震蕩10 min，用酶標儀在570 nm處測定OD值，重復實驗3次。生長抑制率(IR)=(1-加藥組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 培養24 h后，吸掉細胞培養液，實驗組加入終濃度分別為0、10、40、80、160 μM TCP，空白對照組加入培養液，陰性對照組加1‰DMSO，每組設3個復孔，繼續培養48 h。采用Annexin V-FITC/PI雙染技術檢測細胞凋亡。實驗重復3次，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/(凋亡細胞數十正常細胞數)。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCP對786-O細胞增殖的影響 TCP作用24、48、72 h后，10 μM組與0 μM組和1‰DMSO組OD值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；隨作用時間的延長、藥物濃度的增大，抑制作用隨之增強，呈現時間-劑量效應關系(P<0.05)；TCP 48 h的IC50值為67.66 μM；見表1。

表1 TCP對786-O細胞增殖的影響(n=6)

注：*與0 μM TCP組比較，P<0.05。

2.2 TCP對786-O細胞凋亡的影響 TCP作用腎癌786-O細胞48 h，與0 μM組比較，DMSO組和10 μM組凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)；隨著濃度的增高，與0 μM組比較，40 μM、80 μM、160 μM組早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1，圖2。

圖1 不同濃度TCP誘導786-O細胞48 h凋亡情況

*與0 μMTCP組比較，P<0.05。圖2 不同濃度TCP誘導786-O細胞48 h的凋亡率比較

3 討論

組蛋白賴氨酸甲基化是轉錄調節的一個關鍵因素[7]。LSD1能促進包括腫瘤細胞在內的多種細胞的生長并抑制細胞凋亡，抑制其表達可降低腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡[8]。Lv等[9]研究發現，與正常的肺組織相比，非小細胞肺癌(NSCLC)組織中LSD1的表達量顯著增高，且其表達量和NSCLC患者的總生存期呈負相關；同時LSD1的過表達能促進NSCLC細胞的增殖、轉移、浸潤。Jin等[10]構建質粒將LSD1 基因shRNA轉入人結腸直腸癌細胞系HCT116中，沉默LSD1表達，結果發現LSD1缺失可引起體內體外細胞增殖的下調，認為LSD1可能是調控細胞增殖的重要因素之一。Kashyap等[11]發現LSD1在前列腺癌LnCaP、LnCaP:C42和PC3細胞中高表達，應用siRNA技術敲除LSD1基因可以降低血管內皮生長因子(VEGF)水平；帕吉林和反苯環丙胺能有效抑制前列腺癌細胞系的生長，降低前列腺癌的復發。Lan等[12]研究發現，與正常組織相比，LSD1在膀胱癌組織中的表達明顯升高，敲除LSD1可以顯著抑制膀胱癌細胞系的增殖；且LSD1水平與惡性程度呈正相關。課題組前期研究發現，LSD1在腎透明細胞癌中高表達。

TCP是一種單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)抑制劑，能夠通過與FAD的輔基共價結合形成共價復合物而抑制LSD1的活性[13]。LSD1是 Mi-2/核小體重塑(NuRD)、組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)復合體的一個重要組成部分，LSD1/NuRD復合體可以通過影響染色質結構的催化活性來抑制基因轉錄，能夠調控多種信號通路，包括TGF-β1信號通路，參與細胞增殖、細胞生長、上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)等過程的調節[14]。Schenk等[15]用NOD/SCID -IL-2受體-γ缺陷型(NSG)小鼠模型研究LSD1抑制劑TCP和全反式視黃酸(ATRA)聯合治療非早幼粒細胞白血病，結果顯示TCP能顯著下調H3K4me2蛋白的表達水平，提高全反式維甲酸的療效。Huang等[16]在MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞株中聯合應用LSD1抑制劑(TCP、優降寧)和HDAC1/2抑制劑(TSA)，結果顯示它們能夠使H3K4me2和AcH3K9表達水平提高，表現出對乳腺癌細胞生長的協同抑制作用。本研究結果顯示，TCP對腎癌786-O細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈時間-劑量效應關系。

E2F1是細胞周期轉錄因子E2F家族成員之一，參與多種轉錄的調控。抑制LSD1表達可調控E2F1和組蛋白H3K4甲基化，下調Bcl-2、Bcl-1和procaspase-3的表達，上調Bax表達，從而誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖[17]。Ma等[18]報道E2F1在786-O和A498細胞系中高表達，能加速細胞周期中的G1/S轉換，促進癌細胞的生長。本研究采用流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測顯示，隨TCP濃度的增高，786-O細胞早期凋亡和晚期凋亡比例都逐漸增加，提示TCP能夠抑制腎癌786-O細胞增殖并誘導其凋亡，且呈時間-劑量依賴性。另外，本研究結果還顯示，且隨TCP藥物濃度增高，細胞壞死率也增高，提示TCP具有一定的細胞毒性。

綜上，TCP可抑制人腎癌786-O細胞增殖和促進凋亡，后續將進一步研究TCP對LSD1mRNA和蛋白表達的影響，對786-O細胞轉移和侵襲活性的影響，并對其相關通路進行研究。