11種樟科樹枝水提物對樟芝液體培養的比較

景思佳，張 蕾，劉 洋，張 帆

（1. 浙江科技學院 生物與化學工程學院生物工程系，浙江 杭州 310023；2.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；4.杭州市園林科學研究院園林科技科，浙江 杭州 310013）

樟芝Taiwanofungus camphorates 目前自然分布僅在牛樟Cinnamomum kanehirae 腐朽心材內壁或枯死倒地的牛樟樹木材的潮濕表面，為擔子菌門Basidiomycotina 擔子菌綱Hymenomycetes 多孔菌目Polyporales 多孔菌科Polyporaceae 臺芝屬Taiwanofungus[1]，是一種非常珍稀的藥用菌，被稱為“臺灣森林中的紅寶石”。現代研究表明樟芝含有包括三萜類化合物、多糖、腺苷等在內的豐富的活性物質[2]，并證實其具有解酒護肝、抗癌、抗氧化、調節免疫系統、消炎等作用[3-9]。但因為野生樟芝生長條件苛刻，且長勢非常緩慢，導致其子實體價格不菲且一直供不應求。近年來，生長周期短、成本低、易于大規模生產的樟芝液體發酵[10]是人工培養樟芝的重要方法之一，但是目前仍存在生物活性含量較低的問題，所以關于提高樟芝液體發酵產物生物活性含量的研究報道就一直層出不窮。但大多是以生物量、多糖含量及三萜類化合物含量等為檢測目標，對不同碳源、氮源、碳氮比、微量元素等營養條件，初始pH 值、溫度、光照等外界環境因素以及轉速、接種量、溶氧、發酵周期等液體發酵條件來進行單因素或正交試驗的優化。

樟芝是牛樟上發現唯一的腐木菌，故推測牛樟樹中含有促進樟芝生長的某些成分，且因為樟芝寄生病原性并不強，所以牛樟很少因此而死亡，大多都可生長數百年[11]。牛樟是樟科Lauraceae 樟屬Cinnamomum 植物，為臺灣特有的常綠闊葉大喬木，主要分布于臺灣新竹、臺東等海拔在200～2 000 m 的山區。但由于為了獲取椴木來人工栽培樟芝子實體等原因，猖獗的人為盜伐，使原本就稀少的牛樟已經瀕臨滅絕。與牛樟一樣，樟科的植物大多具有藥用和經濟價值，富含揮發油和脂肪油，并含萜類化合物、生物堿、有機酸及多糖等成分[12]，是樟腦或樟油的重要原料。通過添加與牛樟樹同屬或同科的植物提取物來優化樟芝液體發酵產物的報道目前尚無。本實驗室前期通過添加樟腦油（委托安國中藥加工提取，主要成分為樟腦、桉葉素、黃樟素，經檢測有效含量為99.63%）進行液體培養基的優化，得到添加0.2 mL 樟腦油的最優方案，故本試驗挑選11種與牛樟同科同屬或不同屬但在臺灣有自然分布的樟科植物[13-18]，再與前期的實驗最優方案以及無添加的培養作對比，來分析11種樟科植物的提取物對樟芝液體發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 樟芝菌種，2012年于臺灣自然科學博物館引進，在浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室采用超低溫保藏法于－80℃冰箱低溫保藏。

1.1.2 培養基

菌種活化培養基：PDA 39.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，瓊脂10.0 g·L-1，pH 自然。基礎液體種子培養基：PDB 24.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，pH 自然。

基礎發酵培養基：PDB 24.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，pH 自然。

1.1.3 樟科植物 黃樟C.parthenoxylon，華南桂C.austrosinense，樟C.camphora，香桂C.subavenium，銀木C.septentrionale，猴樟C.bodinieri，蘭嶼肉桂C.kotoense，浙江樟C.chekiangense，山橿Lindera reflexa，天竺桂C.japonicum，新木姜子Neolitsea aurata 均取自杭州植物園。

表1 牛樟與本試驗11種樟科植物的情況Table 1 the situation of C.kanehirae and the 11 species of Lauraceae plants in this study

1.1.4 試劑 PDA、PDB、樟腦油、95%乙醇、齊墩果酸標準品、葡萄糖標準品、高氯酸、冰醋酸、香蘭素、香草醛、二氯甲烷、濃硫酸、蒽酮，均購自浙江常青化工有限公司，其中試劑類為國產分析純或化學純。

1.1.5 主要儀器 分析天平，美國PTX 公司；UV-5500PC 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；EYELA旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，美國waters 公司；無菌操作臺，蘇州佳寶凈化工程設計有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樹枝采集 于2015年10 月在杭州植物園采集11種樟科植物的樹枝，由于樟芝僅生長在牛樟樹腐朽的心材內壁或枯死倒地的牛樟木的陰暗潮濕面，故使用高枝剪剪取每種同一株樹5年生以上的老枝，粉碎后得到的樹枝質量均大于100.0 g。

1.2.2 提取物制備 分別將11種樟科植物放入50℃下烘干至恒質量后，再分別粉碎、研磨成粉末過100 目篩后稱質量。分別將100.0 g 樹枝粉末以1:10 的比例放入去離子水中，煮沸1 h，過濾，再將濾渣以1:8 的比例加入去離子水煮沸1 h，過濾后將兩次濾液合并，旋蒸濃縮后，保存在4℃的冰箱內備用。

1.2.3 分組

對照組 A：基礎液體培養基加菌種培養的樟芝菌絲體。

實驗組 B1：在基礎液體培養基中添加黃樟水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B2：在基礎液體培養基中添加華南桂水提物加菌種培養的樟芝菌絲體，B3：在基礎液體培養基中添加樟水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B4：在基礎液體培養基中添加山橿水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B5：在基礎液體培養基中添加香桂水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B6：在基礎液體培養基中添加銀木水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B7：在基礎液體培養基中添加猴樟水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B8：在基礎液體培養基中添加蘭嶼肉桂水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B9：在基礎液體培養基中添加浙江樟水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B10：在基礎液體培養基中添加天竺桂水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B11：在基礎液體培養基中添加新木姜子水提物加菌種培養的樟芝菌絲體；B12：前期實驗室優化培養方案，即在基礎液體培養基中添加0.2 mL 樟腦油培養的樟芝菌絲體。

1.2.4 菌株培養

（1）活化菌株 采用菌種活化培養基對低溫保存的菌株進行活化。配制菌種活化培養基，在121℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min，自然冷卻至室溫，將菌株在無菌條件下接入培養基后，放入28℃人工智能氣候箱，無光培養15 d，保存于－4℃冰箱備用。

（2）液體菌種培養 配制液體種子培養基，在250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 的種子培養基，然后分別添加1 mL 的11種樟科植物的水提物及0.2 mL 的樟腦油，在121℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min，取出培養基，自然冷卻至室溫；在無菌條件下每瓶接入2 粒（2 cm×1 cm）活化好的菌種，封口。在120 r·min-1，28℃的條件下震蕩培養4d。每個樣品設3個重復，對照為種子培養基加菌種培養。

（3）液體發酵培養 配制液體發酵培養基，在250.0 mL 錐形瓶中，加入100.0 mL 的發酵培養基，然后分別添加1 mL 的11種樟科植物的水提物及0.2 mL 的樟腦油，在121℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min，取出培養基，自然冷卻至室溫；在無菌條件下把培養4 d 后的液體種子培養基按10%的轉接量轉入發酵培養基，在120 r·min-1，28℃的條件下震蕩培養4 d。每個樣品設3個重復，對照為及0.2 mL 的樟腦油。

1.2.5 生物量測定 取A，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的發酵液，用3 層200 目的尼龍網過濾，得到菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體3 次后，置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥后，研磨成粉，分別測定樟芝菌絲體粉末的干質量，放于干燥皿中儲存備用。

1.2.6 總三萜含量測定 取前期儲存備用的A，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的菌絲體粉末各0.2 g，測定總三萜的含量。參照陸震鳴等[19]的方法，以齊墩果酸為標準品，采用香草醛-冰乙酸顯色法測定。測定前，采用紫外分光光度計于400～700 nm 波長處進行全波長掃描，結果顯示在550 nm 處具有最大吸光值，所以該反應的吸收波長設定為550 nm。

齊墩果酸標準品溶液：精確稱取齊墩果酸10.0 mg，置于50.0 mL 容量瓶，加二氯甲烷定容至刻度，配制成濃度為0.2 mg·mL-1的標準溶液。

齊墩果酸標準曲線的繪制：精確量取濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標準品溶液0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，分別放入具塞磨口試管中，加熱去除溶劑，然后各加入0.3 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液和及1 mL 高氯酸，加塞。于60℃恒溫水浴20 min，取出后立即用冰水冷卻，再分別加入5.0 mL 冰醋酸，在漩渦混合器混合均勻，在550 nm 處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，齊墩果酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品溶液及總三萜測定：取樟芝菌絲體粉末0.1 g 于10 mL 的蒸餾水中，于100℃水浴回流2 h，冷卻后以1:4 的比例加入無水乙醇，置于4℃沉淀過夜，抽濾，取其濾液各1.0 mL，置于3個磨口試管中，加熱蒸干溶劑，按照繪制標準曲線的方法測定吸光度值，計算不同培養基樟芝菌絲體中總三萜含量[20]。

1.2.7 多糖含量測定 取A，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的菌絲體粉末，測定多糖含量。參照《中國藥典》的方法[21]，以無水葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸法法測定。測定前，采用紫外分光光度計于400～800 nm 波長處進行全波長掃描，結果顯示在620 nm 處具有最大吸光值，所以該反應的吸收波長設定為620 nm。

葡萄糖標準品溶液：精確稱取105℃干燥至恒質量的葡萄糖標準品100.0 mg 定容于1 000.0 mL，配制成濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準液。

葡萄糖標準曲線的繪制：精確吸取0.1%葡萄糖標準液0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，分別放入具塞磨口試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL，各加5.0 mL 蒽酮試劑，震蕩混勻，置于水浴20 min，取出冷卻至室溫，在620 nm 處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品溶液及胞內多糖測定：取樟芝菌絲體粉末0.2 g 于20.0 mL 的蒸餾水中，于80℃水浴加熱2 h，冷卻，然后加入1:4 體積的無水乙醇混勻，置于4℃沉淀過夜，離心分離沉淀、過濾，除去濾渣，得樟芝粗多糖樣品溶液，采用硫酸-蒽酮法測定多糖含量[22]。

1.3 數據處理

采用Excel 2007 軟件進行數據處理，利用DPS 統計分析軟件對數據進行樣本檢驗統計分析。

2 結果與分析

2.1 樟科植物水提物對樟芝生物量的影響

圖1 為11種樟科植物水提物對菌絲體生物量影響的程度及其多重比較結果，各實驗組與A 間差異均極顯著（F=173.34，P＜0.01），其中B12的促進作用最強，其次是B11，雖不屬于樟屬但自然生長海拔和牛樟最為接近、且在臺灣也有自然分布的新木姜子對樟芝生長的促進與B12最為接近，緊隨其后的是B7，雖然猴樟在臺灣沒有自然分布，但海拔在700～1 480 m 與牛樟樹比較吻合。B2，B10，B1，B3，B6，B8，B4，B9對樟芝生長的促進作用依次減弱，而自然分布在浙江、江西、福建等地生長海拔在400～1 000 m 的香桂（對應B5處理）對樟芝生長的促進作用最弱，但與A 相比，促進作用仍然達極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 11種樟科植物水提物對樟芝生物量的影響Figure 1 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on production of biomass

圖2 11種樟科植物水提物對樟芝總三萜含量的影響Figure 2 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on the triterpenoids production

2.2 樟科植物水提物對樟芝菌絲體總三萜含量的影響

從圖2 中可以看出11種樟科植物水提物對樟芝菌絲體總三萜含量的影響，與A 相比，除B4對總三萜含量有抑制作用外，其他樟科植物都表現為不同程度的促進作用，差異極為顯著（F=3 908.5，P＜0.01）。

自然生長海拔和牛樟樹最為接近、且在臺灣也有自然分布的新木姜子雖然不屬于樟屬，但是其對總三萜含量的促進作用最為顯著，與A 相比增加量可達13 倍，與B12相比也提高了85.0 %。其次為B8，與A 相比增加量達10 倍，與B12相比提高了78.5%。且B7、B10對于總三萜含量的促進作用顯著高于B12。緊隨B12后的是B9，B1，B2和B6，均極顯著高于A，且B1和B2之間無顯著差異；與牛樟樹同屬、自然海拔非常接近且在臺灣有自然分布的B3，以及與牛樟樹同屬、自然海拔差不多且自然分布接近的B5對總三萜含量雖促進作用較弱，但與A相比仍達極顯著差異水平。

2.3 樟科植物水提物對樟芝菌絲體總多糖含量的影響

圖3 中與A 相比，除了B3和B9對樟芝菌絲體總多糖含量有較為明顯抑制的作用，大多數樟科植物都能不同程度的提高樟芝菌絲體總多糖的含量，且差異極顯著（F=121.4，P＜0.01）。其中B12的促進作用最為顯著，B11對總多糖含量的促進作用也極為顯著，與A 相比增加量可達5 倍；B7 對于總多糖含量的促進作用緊隨B11后，與A 相比增加量可達3.5 倍。B1，B5，B6，B8均較A 有極顯著差異，但這4 組組間無顯著差異，B10，B2對總多糖的促進作用依次減弱，但與A 相比仍有極顯著差異。

3 結論與討論

樟科植物本身就含有多種活性成分，本實驗結果表明其中的某些成分可促進樟芝菌絲體的生長，提高樟芝菌絲體總三萜和總多糖的含量，只是不同的樟科植物對于樟芝菌絲體的促進程度不同，同時樟科植物中的某些成分可能也會抑制樟芝菌絲體的總三萜和總多糖的含量。

圖3 11種樟科植物水提物對樟芝總多糖含量的影響Figure 3 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on the polysaccharide production

11種樟科植物水提物對樟芝菌絲體的生長均有不同程度的促進作用，其中新木姜子、猴樟、天竺桂和華南桂的水提物對樟芝菌絲體的生長有較明顯的促進作用。11種樟科植物對樟芝菌絲體總三萜含量的影響差異較大，新木姜子、蘭嶼肉桂和猴樟水提物對總三萜含量的影響較大，分別比無添加組增加了13 倍、10 倍和10 倍，比前期優化的液體培養分別提高了85.0%，78.5%和78.5%，產生顯著的促進作用，天竺桂水提物對總三萜含量的影響略大于前期優化的培養基，而其他8種樟科植物在不同程度均有較小的促進作用。11種樟科植物對樟芝菌絲體總多糖含量的影響均不及前期優化的液體培養基，除新木姜子、猴樟水提物對總多糖含量的影響相對較大，更為接近前期優化的培養基的作用之外，與無添加組相比，山橿、黃樟、銀木、蘭嶼肉桂、香桂、天竺桂和華南桂水提物均有不同程度的促進作用，而樟和浙江樟水提物則表現出一定的抑制作用。對樟芝菌絲體的生物量、總三萜和總多糖進行綜合分析，添加新木姜子水提物對于樟芝的液體培養促進作用最為顯著，其次是猴樟。

這11種樟科植物分別屬于樟屬、山胡椒屬和新木姜子屬，而從植物分類學上看分別，前者屬于樟亞科的樟族，后兩者屬于木姜子族。根據ISSR 親緣關系分析，不同屬的樟科植物分類與樟科分類中的族一致，屬間植物完全分開，而屬內植物全聚在一起，與傳統植物形態分類一致，說明屬內植物之間的親緣性更近。根據劉玉香等人的研究表明[23]，樟科植物的核型類型有“1A”，“1B”，“2A”和“2B”四種類型，本次實驗中樟屬的黃樟、樟均為“2A”型，牛樟、銀木為“2B”型，而新木姜子屬的新木姜子和山胡椒屬的山橿分別為“2B”型。一般來說，“2A”型屬于較為原始類型，“2B”型在系統演化中更為進化。在這次實驗中核型表現出差異的樟水提物對總多糖有較為明顯的抑制作用，對總三萜和菌絲體生長均只有非常小的促進作用，與樟同是“2A”型的黃樟促進作用也較低。和牛樟同是“2B”型的新木姜子水提物促進效果最佳，雖然它和牛樟是不同族不同屬，但是同是“2B”型的不同族不同屬的山橿水提物以及同族同屬的銀木水提物卻在菌絲體生物量、總三萜、總多糖上表現出和新木姜子水提物較大的差異。所以相同的核型不是促進樟芝液體培養的唯一因素。

在這11種樟科植物中對于樟芝菌絲體生長的促進作用最小的，且對總三萜、總多糖促進作用都不大的是自然生長海拔最低的香桂，同樣相對低海拔的華南桂的促進作用也不是很明顯；而自然生長在海拔1 450～2 000 m的新木姜子對樟芝菌絲體生長、總三萜和總多糖含量的促進作用最大，而與牛樟、新木姜子相同核型但卻與新木姜子表現出較大差異的山橿和銀木的自然生長海波都在1 000 m 以下；同時，自然海拔在700～1 480 m 的猴樟在菌絲體生長、總三萜和總多糖含量的促進作用都顯著高于前期優化的液體培養基。故我們推測自然生長海拔高的樟科植物和牛樟可能有某些相同的成分，可促進樟芝的液體培養。

從這11種樟科植物的自然分布來看，在臺灣有的新木姜子、蘭嶼肉桂、天竺桂均表現出較好的促進作用。根據臺灣木本植物的大陸親緣性特征分析[24]，雖然受到臺灣島嶼的地質、地形地貌、氣候影響下形成臺灣特有的樹種，但這些植物可能從第3 紀中開始由大陸的西南向東遷移，所以臺灣木本被子植物在大陸更多屬于西南、華南、華東區域，很少屬于西北、東北區域。故雖然猴樟的自然分布在西南區域，也可表現出較好的促進作用，而自然分布在西北的銀木雖然和牛樟樹是相同核型卻因為長久以來環境的差異導致植物體內物質有較大的差異，對樟芝液體培養的促進作用不大。

綜上所述，核型、高海拔、自然分布一致或接近等因素均可能影響到樟科植物內的一些成分，而這些成分中可能具有促進樟芝菌絲體生長、總三萜和總多糖的作用，雖然其作用機制需要進一步研究。但是，樟科植物水提物的添加對樟芝液體培養提高其生物量、總三萜、總多糖含量提供了創新性的方法。