肺動脈高壓動物模型研究進展

陳豫欽 鄺美丹 廖靜 盧文菊 王健

呼吸疾病國家重點實驗室 國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心 廣東省血管疾病重點實驗室 廣州呼吸健康研究院 廣州醫科大學附屬第一醫院呼吸科

肺動脈高壓 (pulmonary hypertension，PH)是一種進行性的致死性疾病，可導致肺血管阻力和肺動脈壓力的進行性升高，從而發展為右心室肥厚、心力衰竭甚至死亡[1]。最新的流行病學數據估計，PH患病率約為全球人口的1%，65歲以上人群PH的患病率高達10%[2]。已經成為嚴重危害人民群眾健康的一大類疾病。加強PH發病機制研究、推進新型藥物研發是提高PH防治水平的必經之路。因此，建立穩定、可重復、與人類疾病發病機制及病理生理學特征相似且制作簡單的動物模型是研究PH的基礎。現將國內外制作PH模型的方法進行綜述，以便研究者根據研究目的選擇適合的動物模型。

1 PH動物模型的分類

按照造模方法分類可分為自發性PH模型和非自發性肺動脈模型。目前自發性PH模型主要是利用基因敲除(gene knock out)和基因嵌入 (gene knock in)技術獲得相應的病理生理變化的轉基因動物。而非自發PH模型則可利用外科手術、藥物及各種環境因素制備。按照疾病產生的病理生理學始發因素，可以將PH模型分為動力性肺動脈高壓 (hyperkinetic pulmonary hypertension)模型和肺血管阻力性肺動脈高壓 (resistance pulmonary hypertension)模型。前者主要為高肺血流動物模型，以分流手術和肺葉切除手術構建的PH模型較為常見。后者包括低氧性PH動物模型、栓塞性PH模型、藥物所致PH動物模型等。

2 實驗動物的選擇

目前用于制作PH的動物包括豬[3]、犬[4]、羊[5-6]等大型動物，以及兔[7-8]、大鼠、小鼠等小型動物。大型動物多應用于高肺血流動物模型以及栓塞性PH模型的制備。在高肺血流動物模型中，選用大型動物便于手術操作，且大動物對手術傷害有較好的耐受性、愈合能力強，與人類疾病的相似程度較高。但大型動物實驗費用昂貴，動物飼養要求高，手術需要多人協助，其中最主要的缺點是無法進行大規模重復實驗。因此，也有研究者采用大鼠制作高肺血流動物模型[9]，此模型對操作者手術技術要求高，但大鼠具有抗感染力強、易恢復的優點，適合手術造模。而栓塞性PH模型的穩定性差，制作復雜，一般使用大型動物的成功率較高。

小型動物中以大小鼠應用最為廣泛，優點為遺傳背景明確、性狀穩定，且實驗成本低，飼養方便，適合大規模研究。例如野百合堿 (monocrotaline，MCT)致PH模型和低氧性PH模型多采用大小鼠進行制備。而轉基因動物研究的模型多以小鼠為主，這與小鼠繁殖力強、轉基因成功率高有關。因此，在制備PH模型時應綜合考慮研究成本、可操作性及動物的耐受程度，選擇合適的動物種類。出于動物福利及研究的重復性，建議盡可能選用小型動物。另外，目前研究者多選用雄性動物制備PH模型，特別是低氧性PH模型，這與雌性動物對低氧具有較好耐受性有關。

3 常用的PH動物模型的制備

3.1 自發性PH模型 主要是利用基因敲除和基因嵌入，使模型動物中某種或多種基因不表達、低表達或過表達，從而自發PH，用于研究與干預基因相關的PH的發病機制。基因敲除可分為系統性基因敲除和條件性基因敲除。系統性基因即對動物體內所有的器官組織細胞中靶基因進行敲除，如小窩蛋白 (caveolin-1，cav-1)[10]、內皮一氧化氮合酶 (endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)[11]及線粒體解偶聯蛋白 (uncoupling protein 2，UCP-2)[12]基因敲除小鼠可自發輕到中度PH。條件性基因敲除是使特定組織器官或細胞中靶基因滅活，如肺內皮細胞BMPR2基因敲除小鼠[13]及內皮細胞的GATA-6基因敲除小鼠[14]可自發PH。有研究者利用Cre/LoxP技術得到PHD2在內皮細胞及造血細胞聯合敲除的小鼠模型，該模型小鼠可自發嚴重的PH，在3.5個月時，右心室收縮壓為60～90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)，并出現新生內膜及叢樣病變，病變呈進行性加重，80%的模型小鼠在6個月時死亡[15]。另外，基因嵌入是根據實驗要求，在目的基因位置引進特定的突變或外源基因。如Chu等[16]通過給大鼠血液注射腺相關病毒攜帶血管生成素1的過表達載體 (adeno-associated virus-angiopoietin-1，AAV-Ang-1)使血管生成素1過表達，60 d后造成PH。5-羥色胺轉運體 (5-Hydroxytryptamine Transporter，5HTT)[17]及IL-6[18]的過表達模型小鼠也可自發PH。

3.2 MCT致PH動物模型 是目前應用最為廣泛的PH動物模型，該方法的優點為造模簡單，成功率高，重復性好。缺點為動物死亡率高，與人類疾病發病機制差異較大。MCT致PH動物模型常出現ALI[19-21]、間質性肺纖維化[22-23]、壞死性肺動脈炎[24-25]、心肌炎[26-28]、肝毒性[29-30]等嚴重并發癥。造模時MCT劑量為45～60 mg/kg體質量[31-33]，皮下或腹腔注射1次，21～30 d后即可造模成功。該模型的病理改變為肺血管平滑肌層明顯增生，并伴有血管內膜增厚，這與其他PH動物模型及臨床上PH患者病理改變不符。MCT導致PH的具體分子機制尚不明確，其引起肺血管重塑是由MCT介導的內皮損傷刺激肺動脈平滑肌細胞增生還是間質細胞肌化造成的還沒有定論[21]。Xiao等[34]發現MCT可以直接激活鈣敏感受體 (calciumsensing receptor，CaSR)，造成肺動脈內皮損傷，進而導致PH。還有研究報道MCT可以造成骨形成蛋白受體Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor，BMPRⅡ)功能障礙和BMP信號中斷[35]、引起NO信號通路障礙[36]、以及明確的肺血管內皮細胞損害[24，37]，這些都可能是其造成PH的部分分子機制。

3.3 低氧性PH模型 慢性低氧是引起PH的重要因素之一[38]。低氧性PH模型是進行第3類PH相關研究的首選模型，其優點為制作方便，重復性好，模型成活率高，適合小型動物造模，與臨床疾病發病機制相似程度高。高原病及睡眠呼吸相關的PH采用該模型也具有較好的相似性。但是制作該模型需要專業的儀器設備，制作成本高。低氧性PH模型可分為常壓低氧模型和低壓低氧模型。制作方法多為低氧動物飼養箱10%氧濃度飼養動物14～21 d[39]。研究者多采用自制的簡易缺氧箱，在模型制備過程中應注意避免箱體內高CO2，保證動物飼養環境。目前已有全自動的缺氧動物模型飼養箱研制成功，應用方便靈活，性能穩定，造模成功率較高。造模2～3周后動物肺動脈可出現病理改變，即顯著的血管重塑及右心肥厚，動物體質量增長遲緩，并伴有肺部炎癥細胞浸潤[40]。低氧性PH模型可以模擬第3類PH患者低氧性血管收縮、炎癥等改變，但無法模擬充氣過度的機械刺激、毛細血管缺失、吸煙的毒性損傷等病理改變。

3.4 肺高血流模型 本模型是通過外科手術方法引起肺血流量的相對或絕對增加，從而造成肺動脈壓力增高，與臨床上部分先天性心臟病引起的PH以及部分栓塞性PH具有相似性。但是該類動物模型肺動脈壓升高都不是很明顯，且模型不穩定，動物死亡率高，只適用于大型動物。該模型制作方法多種多樣，但都涉及復雜的外科手術，動物損傷大，并需要使用呼吸機，可以制作可逆性的PH模型。手術方法包括單側肺動脈結扎[9]、頸動脈-肺動脈分流[7]、主動脈-肺動脈分流[41]、鎖骨下動脈-主肺動脈吻合術[42]、胸主動脈-左肺動脈吻合術[43]等。該類模型的制作，動物的麻醉是手術成功的關鍵因素，目前常用的麻醉方法為氯胺酮與一種肌松藥聯用，術中根據動物體征變化給予維持劑量。先天性室間隔缺損的Yucatan小型豬繼發PH模型也屬于高肺血流模型的一種[44]。

3.5 嚴重PH模型 PH患者在臨床上呈現難治性、進行性惡化的特征。大部分患者初診時已經到達了嚴重階段，很難用藥物控制病情。因此，建立嚴重PH模型，對嚴重PH的發病機制及靶向藥物的研究具有重要意義。嚴重PH模型應滿足以下三個條件：一是肺動脈收縮壓或右心室收縮壓≥60 mm Hg；二是肺血管出現新生內膜或叢樣病變；三是脫離刺激 (如低氧)后，病理改變不發生逆轉。嚴重PH模型通常是采用 “雙重打擊”的方法建立，如低氧聯合內皮生長因子受體 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制劑Sugen(SU5416)誘導的PH模型[45-47]、MCT聯合內皮素受體B(endothelin Breceptor，ETBR)敲除模型[48]、低氧聯合ETBR敲除模型[49]、低壓低氧 (或低氧)聯合MCT模型[50-51]、MCT聯合左肺切除術模型[52]及Sugen聯合左肺切除術模型[53]等。目前最常用的嚴重PH模型是Sugen聯合缺氧誘導的PH(sugen hypoxia induced-pulmonary hypertension，Su Hx-PH)，該模型由于其病程與病理改變與嚴重PH患者具有較高相似性，主要用于第1類嚴重PH的相關研究。其制作方法為一次性皮下注射Sugen后，在10%氧濃度的環境下飼養3周，再置于常氧下數周 (1～11周)。模型鼠隨著造模時間的延長，病變愈加嚴重，其肺血管內膜逐漸增厚，13～14周后，可出現叢樣病變，肺循環阻力逐漸增加，心指數持續下降[45-47]。但是不同品系的大鼠，甚至是不同亞系的大鼠對sugen的反應有差異，通常采用SD(Sprague-Dawley)大鼠進行該模型的制備[54]。嚴重PH的小鼠模型目前尚存爭議。

3.6 栓塞性PH模型 該模型與臨床上第4型PH相似度高。根據栓子來源又可分為自體栓子栓塞法和異體栓子栓塞法，自體栓子多為動物自身血栓[55]，異體栓子包括乳膠微粒栓[56]、異體血栓、瓷栓[4]、氣栓[5]、葡聚糖凝膠栓子[6]、氣囊栓塞[57]等。該模型制作缺點為模型穩定性差，評價困難，制作復雜，需使用大型動物進行制作，且無法模擬臨床上該類患者整體的血流動力學改變及血栓處理后的病理生理改變 (其中包括影響患者術后生存的肺組織缺血再灌注損傷)，大大限制了該類模型的應用。應用介入技術進行定位栓塞將成為該類模型未來制作的方向。

3.7 急性PH模型 多使用藥物或者改變環境因素使模型動物在短時間內出現PH，一般停用藥物或者脫離環境因素后便可恢復正常。此類模型能即時、直觀的反應藥物或者環境因素對肺動脈壓力的影響，多應用于評價藥物急性的舒血管作用及血流動力學急性改變的機制研究。最初主要選用大型動物如羊、豬用于模型制作，近年來越來越多的研究者用大鼠制備穩定的PH急性模型。目前急性PH模型主要是通過持續靜脈注射前列腺素H2/血栓素A2受體激動劑U46619，動態監測肺動脈壓力，使平均肺動脈壓力穩定維持在一定高壓范圍內[58]。由于藥物反應性不同，維持用藥量在不同種屬以及同一種屬的不同個體的之間存在差異，因此實驗前需要摸索給藥濃度及劑量，使平均肺動脈壓力能維持在一個穩定的范圍至少30 min。一般1.0～2.0μg·kg-1·min-1[59]的給藥速率可使羊的平均肺動脈壓維持在25～30 mm Hg，另外有研究者用 (1.1±0.1)μg·kg-1·min-1的給藥速率能使羊的平均肺動脈壓達到35 mm Hg[60]。應用豬制備模型時可使用0.6～0.8μg·kg-1·min-1較小給藥速率靜脈注射U46619，其平均肺動脈壓則可穩定在40 mm Hg左右達3 h[61]。而小型動物如大鼠給藥速率維持在830～1 125 ng·kg-1·min-1[58]也可使平均肺動脈壓維持在25～30 mm Hg。

PH因其發病機制復雜，因此造成PH動物模型制作方法眾多，方法差異大，選用造模動物種類較多，但針對不同類型的PH已建立了與人類疾病具有較高相似度且比較穩定的動物模型。但各種造模方法都有其自身的優勢和局限，已在上文中做了具體的論述。現在最成熟、最常用的PH動物模型為MCT致PH模型、低氧性PH動物模型和Su Hx-PH模型，但MCT致PH動物模型和低氧性PH動物模型無法完全模擬人類疾病的病理生理學改變，應該在研究中引起注意。肺高血流模型及栓塞性PH動物模型目前缺乏成熟的造模方法，無論外科手術或介入方法都存在動物損傷大、死亡率高、模型評價困難等問題。隨著小動物影像評價技術的進步，通過介入技術進行微創定位栓塞或手術，將成為該類模型制作的趨勢。基因編輯制備的自發性PH模型是研究PH發病機制的有效研究工具。除急性PH模型之外，PH動物模型的制作一般造模時間較長，涉及復雜外科手術及大型動物，并且存在模型制作及模型評價對動物造成重復傷害。因此在模型制作過程中應充分考慮動物福利，嚴格遵循實驗動物福利Reduction(減少)、Replacement(替代)、Refinement(優化) “3R”原則，在此提出動物模型制作三點倡議：(1)盡可能選用小型動物，減少動物實驗數量；(2)在滿足實驗要求的前提下減少造模時間，減輕造模過程中動物的痛苦；(3)充分參考其他研究者的造模經驗。綜上所述，PH動物模型的制備應當在具體的研究工作中根據研究目的、研究條件選用適當的動物模型。利用新技術、新儀器建立更符合人類疾病發生發展的模型是未來動物模型制作的發展趨勢。