A族鏈球菌的表面蛋白與宿主相互作用機制

于淼 何其磊 李曉 張鵬翔 馬翠卿

河北醫科大學基礎醫學院免疫教研室 河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室,石家莊050017

A 族鏈球菌 (group Astreptococcus,GAS),通過呼吸道傳播后,可引起化膿性扁桃體炎、咽炎、肺炎、鼻竇炎、中耳炎、猩紅熱等侵襲性細菌感染,兒童20%～30%的急性扁桃體咽炎是由GAS感染引起[1]。在學齡兒童中,由GAS引起的咽炎的患病率每年可達到8%～15%。近年來,在中國所處的西太平洋地區,猩紅熱的患病率有增高的趨勢,香港近十年來第一次報道死亡病例,海南報道急性脊髓炎一例[2-3]。雖然,臨床上多采用青霉素及大環內酯類藥物進行治療,但近年來由于藥物濫用導致耐藥菌株的出現,使得GAS對抗生素藥物的耐藥率逐年增高,而且,目前全球范圍尚沒有有效的疫苗上市,這使得對GAS的發病機制的研究,尋找新的替代治療迫在眉睫。GAS的結構與其致病密不可分,尤其是GAS的表面蛋白在細菌感染過程中發揮著至關重要作用。

1 M蛋白

M 蛋白作為A 族鏈球菌主要致病因子,對于GAS在人體組織和體液中存活起著至關重要的作用。

1.1 M 蛋白的結構 是由兩條具有α螺旋結構的多肽鏈結構構成的二聚體體蛋白,由C端和N 端組成,其C 端錨定于細胞表面,靠近C端的區域為高度保守區;N 端是GAS特異性的基礎,含有保護性抗原表位,而且基本不含人體共同表位,由 A-repeat/N-terminal結構域、B-repeat、C-repeat結構域構成,A 區為高度變異區,能誘導機體產生型特異性調理抗體的抗原決定簇就位于該區,也是血清型(M 型)和基因型 (emm 型)的分類依據;B 區的變異性比A 區低,是抗體非結合區域;C 區為高度保守區,攜帶有一定量的自身分子且可能成為廣譜的疫苗[4]。

隨著基因組學的發展,已經繪制出一些與人類疾病密切相關的GAS的基因序列[5]。幾乎所有的M 蛋白基因都含重復序列,重復序列的第一和第四位氨基酸一般是疏水殘基形成的螺旋,重復序列之間有額外的氨基酸殘基,表明M 蛋白可能有一個靈活的卷曲螺旋結構[6]。M 蛋白的三維結構顯示在氨基末端有四個排列失調引起的結構缺陷,從而導致應有的卷曲結構張開[7]。目前還不清楚這種失調的生物學原因,在一些真核來源的蛋白也能觀察到這種現象[8]。

1.2 M 蛋白的致病機制 可變區B 域與宿主纖維蛋白原結合,導致細菌入侵[9]。M1 蛋白對幾種半乳糖抗原結構有較高的親和力,M1蛋白通過其B 重復域結合宿主細胞半乳糖結構,導致細菌入侵[10]。

M 蛋白與粒細胞的相互作用是其致炎的根本原因。M1蛋白與纖維蛋白原互相結合后被中性粒細胞表面的β2結合素所識別從而激活細胞導致血管破損,毒性物質釋放,從而引起休克綜合征 (streptococcal toxic shock syndrome,STSS)。M1蛋白還可以通過Toll樣受體引起單核細胞釋放細胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha,TNF-α),與纖維蛋白結合的 M 蛋白通過激活血小板的以及激活中性粒細胞和單核細胞,逐步放大它的促炎作用[11-12]。M5還可以作為超抗原誘導大量T 細胞增殖和細胞因子的釋放[13-14],可能會引起猩紅熱和STSS。

M 蛋白還可以激活血凝,促進血栓形成,比如 M1和M3型,可以激活人類單核和內皮細胞的外源性的血凝系統,同時還有另外一些M 蛋白可以通過結合激肽原或緩激肽來激活內源性的血凝系統,兩種不同的血液凝固系統的激活都可以形成血栓[15]。此外M1和M5可以結合未激活的血小板,這依賴血液中的這兩種蛋白的抗體,該抗體一方面與M1和M5結合,另一方面與血小板表面的Fc受體結合,從而激活血小板,促進血栓的形成[16]。凝血因子激活也有保護機體的作用,其在化膿局部活化可降低并發癥,改善小鼠M1鏈球菌感染后的生存率[17]。

M 蛋白與機體的肌球蛋白,層粘連蛋白和角蛋白等,在物理特性和氨基酸的同源性上有較大的相似,刺激抗體產生后可以發生交叉反應,在急性腎功能衰竭,鏈球菌后腎小球腎炎等感染后免疫紊亂的疾病發展進程中發揮了重要的作用。比如M 蛋白羧基端重復區域有一個特殊的可變區稱作M 相關表面蛋白1 (M-associated protein-1,MAP I),與人類心臟上如肌凝蛋白和原肌球蛋白相似,風濕類M 蛋白如M5、M6、M12和M24都有此表位[18],導致風濕類疾病的發生。

M 蛋白還是GAS逃逸的重要分子,M 蛋白位于細菌的絨毛上,遮蓋了細菌補體受體而阻斷了肝急性蛋白(acute phase protein,ACP)調理過程[19]。此外,M 蛋白可以與補體系統中的factor H、factor H-like 1、C4結合蛋白或纖維蛋白原結合,從而避免了與C3b的結合,不能觸發經典及旁路的補體激活系統,從而對抗機體的調理作用,使細菌逃避被吞噬而存在于感染組織中。另外,其還可通過結合于抗體的Fc端來逃避被吞噬。M 蛋白有中性粒細胞吞噬的抗性[20]。例如,M111 蛋白通過抑制活性氧簇(reactive oxygens,ROS)的形成,促進抗炎細胞因子IL-10的產生,從而抑制巨噬細胞功能[21]。M5 亦誘導IL-10產生,進而抑制炎癥的發生[22]。還有些M 蛋白可以與血漿凝血酶原結合從而抑制纖維蛋白的凝集作用,以避免因為纖維蛋白的的聚集而阻止細菌在血液中的擴散[23]。

2 FbaA蛋白

2001年Terao等[24]在化膿性鏈球菌感染的實驗中發現了一種新的纖連蛋白結合蛋白Fba A (fibronectin-binding protein a)它與金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白(fibronection-binding protein A,FnBPA)同源性很高。且發現它是在 Mga 調節子的控制下轉錄的,從而確定了Fba A 是一種新的蛋白。

2.1 Fba A 蛋白的結構 蛋白由雙螺旋的Spy2009基因編碼,Spy2009基因含有1 068個核苷酸,編碼355個氨基酸,相對分子質量為37 800,從N 端起是信號肽區,富含脯氨酸區及C 端的錨定區,存在于鏈球菌的 M1、2、4、9、13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等至少18個血清型中,各型之間的Fba A 蛋白差異不大。

2.2 Fba A 蛋白的致病性 Fba A 是GAS感染的重要毒力因子之一,Fba A 缺陷體的GAS的感染率和致死率明顯降低,提示Fba A 與GAS的感染率和致死率有關。通過制備分段Fba A 單克隆抗體,初步鑒定抗FbaA2段單克隆抗體與補體調節蛋白因子H 和GAS 的結合區域有重疊部位,而且Fba A2段蛋白刺激Hep2細胞后,呈現出自噬相關蛋白LC3-1、P62隨著時間逐漸降低的趨勢。說明Fba A2段也是Fba A 誘導自噬的主要功能區,而且經過后期實驗證明抗Fba A2段單克隆抗體能抑制補體調節蛋白因子H 與A群鏈球菌的結合,從而促進了宿主通過自噬消除GAS[25]。

2.3 Fba A 蛋白的免疫原性 Fba A 能誘導BALB/c小鼠產生特異性IgG 滴度,且用Fba A 免疫的小鼠表現出與M 蛋白相同的保護率,表明Fba A 與M 蛋白在誘導小鼠對GAS激發的保護性免疫方面的能力相似[26]。將Fba A 蛋白分段純化后免疫小鼠,以Fba A68～161aa、Fba A104～277aa蛋白組效價升高較為明顯,說明這兩段能更有效誘導體液免疫應答[27]。

3 A族鏈球菌C5a肽酶(streptococal C5a peptidase from group A streptococcus,SCPA)

SCPA 是細菌重要的毒力因子和保護性抗原,表達于大多數A 族鏈球菌表面且高度保守。免疫應答強,是制備GAS疫苗的候選物。國外科學家已經通過建立一種敏感、特異的酶聯免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法,檢測人血清抗SCPA 抗體[28]。

SCPA 可以發揮補體依賴作用,特異性切割多形核白細胞 (polymorphonuclear leukocytes,PMNL)的趨化因子C5a,阻止C5a與中性粒細胞的結合,抑制炎癥反應時吞噬細胞的攻擊。除此之外,也可與纖連蛋白結合,作為一種細菌的侵襲素,加速GAS 對上皮細胞和內皮細胞的侵襲[29-30]。

SCPA 缺失的突變體與野生的GAS有著不同的傳播途徑,SCPA 缺失的細菌被轉運到淋巴結,而野生型鏈球菌不接觸淋巴結并迅速擴散到脾臟[31]。補體級聯對于清除和控制入侵病原體至關重要,因此是病原體介導的宿主調節的關鍵靶標。C3是補體級聯的中心分子,并且在細菌的調理作用和中性粒細胞向感染部位的募集中起重要作用。C5a、C3、C3a都可以是SCPA 的底物,在SCPA 的作用下,C3被切割成異常大小功能異常的C3a與C3b,減少了細菌表面上的C3沉積。C3a的切割導致中性粒細胞活化,吞噬作用和趨化性的破壞[32]。

4 Sfb蛋白

GAS通過其表面組分如纖維蛋白結合蛋白 (fibrin binding protein)、纖連蛋白結合蛋白 (fibronectin binding protein),作為黏附素入侵宿主上皮細胞內皮細胞。Sfb蛋白 (fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes)是一種纖連蛋白結合蛋白,暴露于化膿性鏈球菌表面,包括SfbⅠ以及SfbⅡ。在測試的93種鏈球菌中超過55%存在SfbⅡ基因,78%的菌株含有Sfbl基因,86%至少攜帶兩個Sfb基因中的一個。

4.1 SfbⅠ SfbⅠ由37個氨基酸序列組成268個氨基酸的肽閱讀框,完全重復三次并且第四次不完全重復。將一個重復序列構建表達后顯示出纖連蛋白結合活性的小融合肽,這表明一個重復含有至少一個結合結構域。SfbⅠ的結構域與金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結合蛋白的38-氨基酸D3重復序列顯示高度同源性,與其他鏈球菌表面蛋白 (包括M 蛋白)的序列比較未能顯示出顯著的同源性。

純化SfbⅠ顯出對纖連蛋白結合和鏈球菌黏附的強烈競爭性抑制。然而純化的鏈球菌脂磷壁酸僅顯示出弱抑制,表明SfbⅠ直接參與纖連蛋白介導的GAS對上皮細胞的黏附[33]。SfbⅠ通過內部硫酯鍵作為介導與纖維蛋白原中一種特定的賴氨酸殘基反應,形成非常穩定的分子間酰胺鍵,介導GAS黏附到宿主細胞,進而啟動GAS 內化的吸收過程[34]。

用含M 蛋白和SfbⅠ兩種抗原的脂質核心肽 (the lipld cove peptide,LCP)疫苗對BALB/c小鼠進行鼻內免疫接種,在用致死劑量的化膿性鏈球菌菌株進行呼吸攻擊后,小鼠受到完全保護,而在分別用LCP-J8 和LCP-FNBR 免疫的小鼠存活率相對低[35]。在基于肽結合疫苗動物接種實驗中,相比于M1蛋白 (J8)的結合疫苗,SfbⅠ的表位肽與白喉類毒素的結合疫苗保護水平更高[36]。說明SfbⅠ在預防化膿性鏈球菌上有一定的潛力,而且它特異識別纖維蛋白的靶點也可以有進一步的應用。

4.2 SfbⅡ SfbⅡ基因來自A 組鏈球菌菌株A75的染色體DNA 的λEMLL3文庫,并編碼113 000蛋白質,表現出革蘭陽性球菌的膜錨定表面蛋白質的特征。蛋白質C 末端部分有纖連蛋白結合結構域。它由兩個半重復序列組成,它們與其他鏈球菌和葡萄球菌蛋白纖連蛋白結合蛋白重復序列具有共同的基序。SfbⅠ、SfbⅡ這兩種蛋白質不具有共同的免疫原性表位[37]。

5 血清不透明因子(serum opacity factor,SOF)

SOF表達在大多數GAS表面,是GAS重要的毒力因子、黏附素,可以使人血清變不透明及介導細菌對上皮細胞的侵襲。SOF是一種纖連蛋白結合蛋白,分子結構中含有具有纖連蛋白結合 (Fn結合)活性的重復結構域,陰性突變體中GAS結合纖連蛋白現象出現大幅度的減少[38-39]。M75的纖連蛋白結合蛋白SfbⅡ與M22的SOF22基因序列有99%的同一性,僅有4個氨基酸的差異[40]。

SOF通過結合apo A-Ⅰ和apo A-Ⅱ與人血液中的高密度脂蛋白 (high density lipoprotein,HDL)相互作用導致HDL脂質的釋放,其融合形成脂滴,導致血清渾濁化。HDL的破壞可以減弱HDL的抗炎功能,從而有助于GAS致病[41]。

SOF同時也可以與細胞外基質蛋白纖維蛋白1(fibulin-1)相互作用,纖連蛋白、纖維蛋白與SOF結合的結構域是分開且不同的,而纖連蛋白,fibulin-1,纖維蛋白原和SOF形成的分子復合物,增強了GAS對宿主細胞黏附侵襲的能力[42]。另外,SOF是fibulin-1蛋白的受體,但并不是唯一受體[43]。研究顯示,SOF可以激發宿主產生調理性抗體,M2和SOF2蛋白的抗血清的組合在殺滅鏈球菌方面比單獨的抗血清更有效,并且SOF的不同血清型具有共同的表位,因此SOF是預防A 族鏈球菌感染的候選疫苗之一[44]。

6 A族鏈球菌類膠原蛋白(streptococcal collagen-like,SCL)

SCL有兩種,結構相似,Lukomski等[45]稱之為SCL1和SCL2,而Rasmussen等稱之為SCLA 和SCLB[46]。SCL的胞外部分為N 末端非膠原可變區 (V 區)和一個由重復的GXY (G：甘氨酸;XY：代表其他氨基酸)三聯體組成的類膠原區 (CL區)形成穩定的三螺旋結構。在羧基端為保守的細胞壁區 (W 區)。

構建重組Scl1 (rScl1.41)后發現其CL 區可以和人的膠原蛋白受體結合,如a2b1整聯蛋白,rScl1.41與整聯蛋白的結合可促進人的肺纖維原細胞的吸附與擴散,引起細胞內一些與整聯蛋白相關的信號分子的磷酸化,如黏著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)、丙酮酸激酶 (pyruvic kinase 2,Py K2)、整聯蛋白連接激酶1 (integrin-linked kinase 1,ILK-1)等[47]。同時某些CL區含有GLPGER 模體的Scl1可以和a2b1及a11b1結合[48]。

一些證據表明低密度脂蛋白 (low density lipoprotein,LDL)在防御病原微生物感染方面具有的積極的作用[49-50]。而rScl1的V 區與ApoB100和LDL可以特異性結合,且具有濃度依賴性。但是這種相互作用是有利于機體的抗感染作用還是有利于病菌入侵,還有待于進一步的研究[51]。凝血酶激活的纖溶抑制劑 (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI)可通過Scl1.41、Scl2.41與鏈球菌結合,并且在GAS菌體表面被激活。活性TAFI是纖維蛋白溶解作用的抑制因子,并且可以調節炎癥反應。SCL 與補體調節蛋白H 因子有相互作用,GAS可以通過與H 因子的結合而避免補體介導的調理作用和吞噬作用。同時SCL 與H因子結合補體C3b的裂解有輔助作用[52],有助于GAS逃逸宿主機體的免疫系統的應答。

7 FBP54

纖維蛋白原結合蛋白 (fibrinogen binding protein,FGN)纖連蛋白 (fibronectin,FN)是細菌與宿主細胞結合的受體。除先前提到的多種表面蛋白,FBP54也是一種可以與纖連蛋白以及纖維蛋白原結合的表面蛋白。該蛋白有54 000,通過構建融合蛋白表明,FBP54的FN/FGN 結合結構域是包含在N 端殘基1～89[53]。并且FBP54在宿主體內優先介導對某些細胞的黏附。

實驗發現,當FBP54以劑量相關的方式作用于人頰上皮細胞,阻斷對人頰上皮細胞80%的黏附時,FBP54對A組鏈球菌與HEp-2組織培養細胞的黏附幾乎沒有影響。鏈球菌感染后腎小球腎炎和急性風濕熱的患者血清有FBP54在體內表達且在人宿主中具有免疫原性[54]。

8 小結與展望

到目前為止,相關學者對GAS致病機制的研究一直未曾停止過,從上述研究中,可以看出GAS致病機制的復雜性,其表面蛋白不僅可以介導細菌與機體的結合,引起炎癥反應,增加致病性,亦可以逃避機體免疫系統的識別使細菌擴散。希望我們對表面蛋白的結構和相應的致病機制的研究綜述,尋找更好的治療GAS感染方法,能夠為防御GAS感染、尋找更好的治療方法提供新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突