應用酵母雙雜交系統篩選蝦夷扇貝FOXL2的相互作用蛋白?

張 陽， 張玲玲，2??， 李若佼， 謝欣冉， 李仰平， 李婉茹， 包振民，2

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島266003; 2. 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，青島海洋科學與技術國家實驗室，山東 青島 266237)

FOXL2(Forkhead box L2)是叉頭轉錄因子超家族的成員之一，在脊椎動物性別決定與分化的過程中發揮關鍵作用，主要參與卵巢早期發育及成體卵巢的功能維持。迄今，已在多個物種中鑒定了FOXL2基因[1-5]，但較深入的研究主要集中在脊椎動物。研究發現，該基因在大多數哺乳動物的性腺中呈性別二態性表達模式。FOXL2在人性別分化前的生殖嵴細胞中表達，且在卵巢中特異性表達[1]。小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、紅耳龜(Trachemysscripta)的早期卵巢中檢測到，FOXL2在性別決定前后表達，推測該基因參與了卵巢分化[6]。FOXL2缺失突變的XX型小鼠，其性腺表現出精巢特征，表明FOXL2對成體的卵巢具有維持功能[7]。此外，FOXL2已被確定為山羊(Caprahircus)的雌性決定基因[8]。Oshima等也發現蛙(Ranarugosa)的FOXL2在卵巢分化的早期階段起著關鍵作用[9]。在羅非魚(Oreochromisniloticus)中，FOXL2基因在卵巢分化早期到成體持續表達，說明該基因參與了魚類性腺分化以及卵巢的功能維持[10]。

雖然在一些無脊椎動物中已經獲得FOXL2基因，但關于該基因的研究相對較少。Zhang等分析了太平洋牡蠣(Crassostreagigas)FOXL2基因在性腺等組織的表達情況，認為該基因可能是牡蠣性別決定的關鍵基因[11]。在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中，FOXL2基因也呈現性別二態性表達，推測其為雌性相關基因[12]，并可能參與卵巢分化[13]。Li等分析了蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的精巢和卵巢轉錄組，認為FOXL2是蝦夷扇貝性別決定/分化的關鍵候選基因[14]。珠母貝(Pinctadamargaritifera)的研究也發現FOXL2在其性反轉和性別分化過程中起著重要作用[15]。

由此推測，FOXL2很可能是跨無脊椎動物和脊椎動物類群的保守的雌性決定與分化的關鍵基因。在脊椎動物中，FOXL2主要通過調控芳香化酶CYP19A1的表達，決定或維持雌性性別[16-17]；但已有研究顯示，CYP19A1在脊索動物才出現[18]，在諸如扇貝之類的無脊椎動物并不存在。可見，FOXL2性別決定的機制在脊椎動物與無脊椎動物之間可能有所不同。該基因在無脊椎動物中究竟與哪些蛋白相互作用，如何行使功能，目前尚不清晰。本研究將以蝦夷扇貝為材料，應用酵母雙雜交系統初步篩選與FOXL2相互作用的蛋白，為解析無脊椎動物FOXL2的性別決定機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料二齡蝦夷扇貝采自遼寧省大連市獐子島養殖中心，取扇貝性腺組織，液氮固定后保存于-80 ℃冰箱以備提取RNA。蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫和E．coliDH5α由本實驗室保存；酵母菌株Y2HGold和Y187購自Clonetech公司；限制性內切酶購自Takara公司；X-α-Gal、Aureobasidin A(AbA)、MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System試劑盒和YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒及各種酵母缺陷型培養基均購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 誘餌質粒pGBKT7-FOXL2的構建 參考In-Fusion?HD Cloning Kit說明書設計蝦夷扇貝FOXL2基因的PCR引物，在FOXL2基因的ORF區5’端引入一段與線性化載體pGBKT7末端同源的16個堿基序列，引物序列如下：FOXL2-F：5’-CATGGAGGCCGAATTCATGGCCTTGTCATTTTACGACTCC-3’，FOXL2-R：5’-GCAGGTCGACGGATCCTCACCTCTCTCCCCAGTACGTGTA-3’(下劃線部分為線性載體同源序列)；提取蝦夷扇貝性腺組織RNA，以反轉錄的蝦夷扇貝cDNA為模板，高保真DNA擴增酶擴增FOXL2基因片段，純化PCR產物。利用EcoR Ι和BamH Ι雙酶切空載體pGBKT7并純化。將純化后的目的基因和線性化載體pGBKT7構建In-Fusion反應體系，50 ℃孵育15 min，然后置于冰上，反應液轉化E.coliDH5α，于含有卡那霉素的LB固體培養基37 ℃過夜培養。挑取單克隆，菌液PCR驗證，陽性克隆提取質粒并測序。

1.2.2 誘餌蛋白毒性及自激活檢測 利用YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒制備以及轉化酵母感受態。將誘餌質粒pGBKT7-FOXL2、空載體pGBKT7分別轉化到Y2HGold感受態細胞中，涂布于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal固體培養基；質粒pGBKT7-53和pGADT7-T、質粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化Y2HGold感受態作為陽性對照和陰性對照，涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal固體培養基，30 ℃培養3～5 d，觀察酵母菌株的生長情況，檢測誘餌蛋白對酵母菌株是否具有毒性和自激活活性。

1.2.3 蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫滴定實驗 實驗室前期已構建蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫，將1/100，1/10 000的文庫稀釋液涂布于SD/-Leu固體培養基，30 ℃培養3～5 d，統計菌落個數，計算文庫滴度。

1.2.4 酵母雙雜交篩選FOXL2互作蛋白 從SD/-Trp固體培養基挑取2～3 mm的Y2HGold[pGBKT7-FOXL2]新鮮克隆，于50 mL SD/-Trp液體培養基30 ℃過夜培養，至OD600達0.8。離心，棄上清液，4～5 mL SD/-Trp液體培養基重懸菌體并置于2 L的錐形瓶中，加入1 mL蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫和45 mL含有50 μg/mL卡那霉素的 2×YPDA液體培養基，30 ℃、30～50 r/min培養20～24 h，離心，10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的0.5×YPDA液體培養基重懸菌體。各取100 μL 1/10，1/100，1/1 000，1/10 000的稀釋雜交菌液涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp固體培養基，30 ℃培養3～5 d后，統計各板菌落數，計算雜交效率。剩余雜交菌液涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養基，30 ℃培養3～5 d。挑取培養基上長出的藍色單菌落，接種到高篩選強度的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上，進一步篩選出藍色陽性克隆，提取陽性克隆酵母質粒，PCR鑒定并測序。

1.2.5 共轉化驗證 陽性克隆酵母質粒轉化E.coliDH5α，于含有氨芐青霉素的LB固體培養基進行選擇培養，提取獵物質粒，分別和質粒pGBKT7-FOXL2共轉化Y2HGold感受態細胞，30 ℃培養3～5 d后，觀察酵母菌株的生長情況。

2 結果

2.1 誘餌質粒pGBKT7-FOXL2的構建

根據蝦夷扇貝FOXL2基因序列和線性化載體pGBKT7序列設計特異性引物，PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小在1 000～2 000 bp之間，與理論值(1 139 bp)一致(見圖1)。構建的誘餌質粒轉化E.coliDH5α，陽性克隆進行測序。序列比對分析確定陽性克隆包含蝦夷扇貝FOXL2基因的ORF框序列，重組的誘餌質粒讀碼框無移碼突變，說明誘餌質粒pGBKT7-FOXL2構建成功。

2.2 誘餌蛋白毒性及自激活檢測

將誘餌質粒pGBKT7-FOXL2、空載體pGBKT7分別轉化Y2HGold感受態細胞，涂布于SD/-Trp固體培養基。結果顯示兩者菌落大小相近(見圖2)，說明誘餌蛋白無毒性。將誘餌質粒pGBKT7-FOXL2轉化Y2HGold感受態細胞，涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養基，結果如圖3A所示，誘餌質粒pGBKT7-FOXL2轉化的酵母細胞在SD/-Trp/X-α-Gal培養基上長出單菌落但未變藍。而陽性對照共轉化質粒pGBKT7-53和pGADT7-T的酵母細胞在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養基上生長且顯藍色(見圖3B)，陰性對照共轉化質粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T的酵母細胞在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養基上生長但不顯藍色(見圖3C)。這說明pGBKT7-FOXL2誘餌蛋白不能激活報告基因MEL1，誘餌蛋白無自激活活性。

(F：FOXL2基因PCR產物；M：DNA分子質量標準(DL2 000)。F:FOXL2 PCR product; M: DL2 000 DNA marker. )

圖1FOXL2基因PCR產物電泳圖
Fig.1 Electrophoretic result ofFOXL2 PCR product

(A：pGBKT7-FOXL2涂布SD/-Trp培養基；B：pGBKT7涂布SD/-Trp培養基。A: pGBKT7-FOXL2 on SD/-Trp medium; B: pGBKT7 on SD/-Trp medium. )

圖2 誘餌蛋白毒性檢測
Fig.2 Testing on the toxicity of bait protein

(A：pGBKT7-FOXL2涂布SD/-Trp/X-α-Gal培養基；B：陽性對照(pGBKT7-53 + pGADT7-T)涂布SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養基；C：陰性對照(pGBKT7-Lam + pGADT7-T)涂布SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養基。A: pGBKT7-FOXL2 on SD/-Trp/X-α-Gal medium; B: positive control (pGBKT7-53 + pGADT7-T) on SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal medium; C: negative control (pGBKT7-Lam + pGADT7-T) on SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal medium. )

圖3 誘餌蛋白自激活活性檢測
Fig.3 Testing on the autoactivation of bait protein

2.3 文庫滴定結果

稀釋104倍的50 μL文庫稀釋液涂布SD/-Leu培養基，獲得約200個酵母單菌落。根據滴度計算公式：滴度=(菌落個數/涂板體積mL)×稀釋倍數，計算得到文庫滴度為4×107cfu/mL，大于2×107cfu/mL，說明蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫符合酵母雙雜交的滴度要求。

2.4 FOXL2互作蛋白的篩選

酵母雜交菌液涂布后，統計各培養基平板的菌落個數，經計算共篩選的二倍體克隆數為6×106，雜交效率為7.14%，符合實驗要求。本研究利用酵母雙雜交系統，在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養基上篩選出24個藍色單菌落，進一步在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上篩選出17個藍色陽性克隆(見圖4)。

提取藍色陽性克隆酵母質粒進行PCR鑒定(見圖5)，結果顯示陽性克隆均含有插入片段，片段大小主要集中在750～2 000 bp。陽性克隆酵母質粒轉化E.coliDH5α，涂布于含有氨芐青霉素的培養基后，提取獵物質粒，測序鑒定。測序結果在NCBI數據庫進行比對，驗證出12個讀碼框正確的陽性克隆，共得到4種蝦夷扇貝FOXL2的候選相互作用蛋白，分別是COP9信號復合體亞基5、鈉/鉀ATP酶β3、哺乳動物室管膜相關蛋白1和胰脂肪酶相關蛋白2(見表1)。

圖4 酵母雙雜交篩選陽性克隆結果圖Fig.4 The positive clones screened by yeast two-hybrid system

圖5 FOXL2篩選的陽性克隆PCR鑒定結果(部分)Fig.5 Identification of the positive clones by PCR (partial)

候選互作蛋白Candidate interacting proteins登錄號Accession number克隆個數No. of clonesCOP9信號復合體亞基5 COP9 signalosome complex sub-unit 5XP_021363137.14鈉/鉀ATP酶β3 sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3XP_021377712.14哺乳動物室管膜相關蛋白1 mammalian ependymin-related pro-tein 1-likeXP_021339375.13胰脂肪酶相關蛋白2 pancreatic lipase-related protein 2-likeXP_021367396.11

2.5 共轉化驗證結果

將4種互作蛋白的獵物質粒分別和質粒pGBKT7-FOXL2共轉化Y2HGold感受態細胞，涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養基。共轉化實驗結果(見圖6)顯示，培養基上均出現藍色菌落，說明激活了報告基因的表達，驗證結果均為陽性，表明這4種蛋白與蝦夷扇貝FOXL2都可能存在相互作用。

圖6 4種FOXL2互作蛋白的共轉化驗證Fig.6 Cotransformation analysis between FOXL2 and the four interacting proteins

3 討論

蝦夷扇貝屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectenidae)，是具有重要經濟價值的海洋貝類。蝦夷扇貝全基因組測序的完成，為我們提供了一個全新的視角去探究FOXL2在無脊椎動物中的功能。本實驗室前期研究發現，與脊椎動物相似，FOXL2很可能參與蝦夷扇貝的卵巢發育和維持。但FOXL2在無脊椎動物中的研究較少，對該基因的功能分析還不夠深入。本研究成功構建了重組誘餌質粒pGBKT7-FOXL2，且實驗表明誘餌蛋白對酵母菌株無毒，也無自激活活性，可以進行后續實驗。利用酵母雙雜交系統共篩選出了4種可能與蝦夷扇貝FOXL2的相互作用蛋白，為研究FOXL2基因在蝦夷扇貝中的功能提供了參考。

研究結果顯示，COP9信號復合體亞基5(COP9 signalosome complex subunit 5，CSN5)是FOXL2的候選互作蛋白。COP9信號復合體(CSN)由8個亞基組成，在物種間較為保守[19]。CSN的主要功能是參與去Nedd化(Deneddylation)和磷酸化反應，它能使E3泛素連接酶的Cullin去Nedd化，從而調控Cullin-Ring泛素連接酶的活性。CSN5是COP9信號復合體的第五個亞基，具有催化中心并可以穩定的獨立存在，對CSN起著關鍵作用[20]。研究發現，CSN5的對應蛋白BmJM在家蠶(Bombyxmori)生殖腺的表達水平較其它組織高，推測家蠶CSN5蛋白通過參與細胞周期相關蛋白的降解來調控細胞增殖發育過程[21]。Doronkin等發現果蠅(Drosophilamelanogaster)中CSN5突變阻止Gurken蛋白在卵母細胞中的積累，說明了CSN5對卵子發生的重要性[22]。Smith等利用RNAi干擾秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)CSN5，發現F1代線蟲卵子發生缺陷，導致其性腺變小且缺少卵母細胞，由此可知CSN5對線蟲卵子發生具有關鍵作用[23]。酵母雙雜交實驗初步表明CSN5與蝦夷扇貝FOXL2相互作用，鑒于CSN5在細胞周期和配子發生中的重要作用，推測CSN5可能調控FOXL2蛋白的表達進而影響卵子發生過程。此外CSN能使一些轉錄因子磷酸化，關于CSN5與FOXL2之間的作用還有待進一步研究。

蝦夷扇貝酵母雙雜交結果顯示FOXL2和胰脂肪酶相關蛋白(Pancreatic lipase-related protein，PLRP)具有直接的相互作用，這與之前的研究結果一致。比如，Kim等在扇貝卵巢中獲得了編碼PLRP的基因，RT-PCR結果顯示該基因在卵巢中高表達，而在精巢中低表達，暗示PLRP在扇貝卵母細胞的成熟和卵黃發生時期的脂質代謝中發揮作用[24]。Dheilly等在太平洋牡蠣中篩選得到配子形成早期表達的雌性特異性基因，其中就包括FOXL2和PLRP[25]。以上研究結果說明FOXL2和PLRP關系密切，可能共同參與卵巢發育過程。

哺乳動物室管膜相關蛋白1(Mammalian ependymin-related protein 1，MERP1)和鈉/鉀ATP酶β3(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3)是扇貝FOXL2的另兩個互作蛋白。目前室管膜素相關蛋白的功能尚不清晰，但室管膜素相關蛋白在成體小鼠卵巢的體細胞中表達量較高[26]，這與FOXL2主要在卵巢中表達這一現象類似，暗示MERP很可能與FOXL2有直接的相互作用。此外，已有研究發現，鈉/鉀ATP酶是主動跨膜轉運鈉鉀離子的載體蛋白，具有信號傳導功能，參與調控基因的表達及細胞的生長[27]。鈉/鉀ATP酶還可能通過腦對卵巢的激素發揮調控作用[28]。由于相關報道較少，鈉/鉀ATP酶與FOXL2之間到底有怎樣的聯系有待進一步的研究。