代謝組學在顱腦創傷中的應用研究進展▲

秦雅靜 符 鋒 陳忠彥 孫洪濤 鐘瑞霞 劉 洋

(1 中國人民武裝警察部隊特色醫學中心神經危重癥醫學科，天津市 300162，電子郵箱：272140356@qq.com；2 上海市第四人民醫院神經內科，上海市 200081)

【提要】 顱腦創傷是人類致殘、致死的主要原因之一。由于受傷機制和腦組織的復雜性，顱腦創傷可誘發廣泛的病理生理學改變。代謝組學可提供顱腦創傷患者單一時間點生理、生化狀態的“瞬時快照”。目前，高通量、高靈敏度的代謝組學分析工具能夠檢測和定量小濃度的代謝物，使客觀化、精細化評估顱腦創傷成為可能。本文就代謝組學的概況及其在顱腦創傷診療、預后評估等方面的研究進展做一綜述。

顱腦創傷是由外部機械力引起的神經學損傷，為人類致殘、致死的主要原因之一，遺留的神經功能和認知障礙給患者及其家庭帶來巨大影響[1]。調查研究顯示，全球每年新增5 200萬～5 600萬輕度顱腦創傷患者和2 200萬～3 600萬中重度顱腦創傷患者[2]，2017年全球因顱腦創傷造成的經濟負擔為3 620億～4 450億美元，相當于全球生產總值的0.5%[2]。目前，臨床評估和神經影像學是顱腦創傷診斷與預后評估的主要手段，但由于顱腦創傷的損傷機制和臨床癥狀的異質性使目前的評估方法尚不能滿足顱腦創傷患者的個性化治療，尤其是輕度和中度顱腦創傷患者[3]。代謝物是體內所有生物化和病理生理過程的組成部分，目前的高通量和高靈敏度的分析工具能夠檢測和定量低濃度的代謝物。因此，以生物液體為樣本的代謝組學檢測技術在顱腦創傷診療和預后評估方面較單純的臨床癥狀及神經影像學可能更可靠、實用。本文就代謝組學及其在顱腦創傷診療及預后評估中的研究進展進行綜述。

1 代謝組學概況

1.1 代謝組學的基本特征 代謝物組是某一時刻生物體內所有代謝物的集合，其濃度隨宿主對內部或外部刺激后病理生理的變化而變化，反映環境因素和遺傳因素在宿主表型上的相互作用。代謝組學是對小分子代謝物(分子量<1 kD)識別和量化的整合研究[4]，可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。靶向代謝組學被用于定量數量有限的已知代謝物，而非靶向方法用于半定量盡可能多的代謝物(包括樣品中已知和未知的代謝物)[5]。血液、唾液、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、眼淚、糞便、精液、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和呼出氣冷凝物等多種樣品均可用于代謝組學研究。代謝產物可能是病因特異性的或非特異性的標志物，取決于樣品來源和涉及的生物學途徑[6]。因此，代謝組學已經改變了“生物標志物”的概念，其不僅可量化代謝物，還識別疾病的代謝模式，即代謝指紋或生物模式[7]。代謝組學提供了在特定時間點細胞或組織(器官)的分子狀態的綜合視圖，包括在基因組學或蛋白質組學分析中未見到的表觀遺傳學影響。如果在臨床表現出現之前檢測到代謝改變的信號，則可能早期診斷和治療某種疾病，從而增加成功治療或治愈的可能性。

1.2 代謝組學分析平臺 用于代謝組學研究的高通量分析平臺可以分為檢測技術和分離技術或兩者的組合。其中，核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)和質譜(mass spectrum，MS)用于檢測代謝物，氣相色譜(gas chromatography，GC)或液相色譜(liquid chromatography，LC)用于分離代謝物[8]。而GC-MS和LC-MS等聯用技術是高靈敏度和準確度的分析工具，兩者已被廣泛應用于鑒定人類生物樣品中的數千種代謝物。

GC-MS可以用于半定量鑒定低濃度的化合物，尤其是揮發性化合物。衍生化方法可以增加非揮發性化合物的揮發性和熱穩定性，以便用于GC-MS分析。基于不同分子對由特殊聚合物制成的固定相親和力的差異，可在氣體加熱柱(氣相色譜)中徹底分離生物樣品中的衍生分子。根據分子的質荷比，質譜儀在復雜的物理化學過程中離子化和鑒定每個分子。分離和檢測技術的結合可根據保留時間和質荷比確定化合物，由此成為代謝組學高分辨率工具[9-10]，如增強型色譜柱、離子源、質量分析儀和化合物文庫等GC-MS領域最新的創新性發展技術，提高了鑒定代謝物的靈敏度和特異性。GC-MS可用二維方法(即二維色譜模式)，如串聯層析(GC/GC-MS)或串聯質譜分析儀(GC-MS/MS)，以增強代謝物的鑒定效果，從而檢測出在常規GC-MS中未能被識別的多種化合物[11]。

LC-MS是一種功能強大、靈敏度高的代謝組學分析技術，僅需少量樣品且無須高溫條件就可檢測代謝物。該技術在LC中通過流動相(溶劑)和固定相之間的相互作用將化合物分離，并在質譜儀中鑒定分離出的化合物。LC-MS是一種極其敏感的代謝組學方法，能夠檢測小于1 pg的分子[12]，其是識別非極性、非揮發性、半極性化合物和熱不穩定化合物的可靠技術[13-14]。目前高壓GC-MS、超高壓GC-MS和親水相互作用LC-MS均已被用于代謝組學的研究。

2 代謝組學在顱腦創傷中的應用前景

異質性是影響顱腦創傷診斷和預后的主要難題，格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale，GCS)評分、創傷后應激障礙持續時間、傷后天數、多發傷以及頭部損傷次數均是影響顱腦創傷異質性的重要因素。目前的影像技術和臨床評估方法評估神經損傷的敏感性低，而使用單一代謝物作為診斷生物標志物的研究并不可行[15]。代謝組學可以通過代謝譜對患者進行聚類來降低診斷顱腦創傷的異質性，其有望成為精確診斷顱腦創傷的技術，尤其是適用于輕度顱腦創傷[16]。

顱腦創傷的預后評估也是神經科醫師面臨的一個挑戰，年齡、性別和遺傳因素等因素均可能影響患者的病程和預后。通過測定新型代謝生物標志物的變化以區分顱腦創傷的各個階段，有助于評估患者的預后[17]。基于代謝組學技術分析出的小分子代謝物可用于準確識別易發生后遺癥的患者，進而有助于針對個體進行特殊康復治療。

代謝產物可作為鑒別局灶性和彌漫性顱腦損傷、原發性和繼發性顱腦損傷的生物標志物[18]。由于代謝物的濃度和類型可能會隨著受損區域的變化而變化，因此代謝組學可以用于定量評估顱腦損傷，如神經元特異性烯醇化酶、S100β和血影蛋白分解產物等蛋白質生物標志物的濃度在局灶性與彌漫性顱腦損傷患者中存在差異[18]。此外，在目前缺乏敏感的神經影像學技術用于識別特定解剖學損傷的情況下，基于顱腦創傷的損傷解剖位置呈特異性改變的代謝物檢測可更好地對患者進行分類并預測結局。研究表明，對于重復性顱腦創傷，代謝組學可能有助于識別具有高復發性腦震蕩風險的運動員，或更準確地評估復蘇進展；連續采樣及監測生物標志物可以闡明患者的情況、確認重復性顱腦創傷引起的累積效應、識別與執行功能缺陷相關的模式，以防止腦震蕩的反復發作[19]。

3 代謝物-生物標志物在顱腦創傷中應用的研究進展

3.1 代謝物-生物標志物有助于探索顱腦創傷病理生理學機制 了解顱腦創傷相關代謝物的變化可以揭示顱腦創傷病理生理級聯信息，從而探索潛在的干預靶點。顱腦創傷患者CSF和血液中的代謝物濃度常常不同，CSF中的代謝物可用于評估顱腦創傷患者血腦屏障的功能性。代謝物分析可以用于闡明顱腦創傷繼發性損傷所涉及的細胞和分子機制[20]，基于代謝組學的研究有助于預防或減少顱腦創傷繼發性損傷。

谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是大腦內的主要神經遞質。谷氨酸是一種興奮性神經遞質，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，從而介導廣泛的生物學效應[21]。顱腦創傷發生后由于神經功能障礙和細胞死亡，腦代謝明顯增加，易因缺氧、低血壓和癲癇發作而造成顱腦繼發性損傷；糖酵解使血清乳酸水平增加，進而導致神經元功能障礙并損害血腦屏障，最終導致腦水腫[22]。代謝物-生物標志物可反映顱腦創傷后功能性腦損傷、繼發性腦損傷和神經代謝級聯的時間過程，包括評估膜結構響應代謝、ATP依賴性離子泵、細胞能量代謝和腦血流量。高通量分析工具能夠識別與代謝變化、離子和微絲化合物改變相關的軸突損傷代謝物，如監測到過量的興奮性氨基酸神經遞質(如谷氨酸、磷脂酰絲氨酸等)，則提示細胞凋亡的開始[23]。

3.2 代謝組學在顱腦創傷動物模型中的應用 動物模型已被用于研究顱腦創傷，并已發現基于代謝組學的新型生物標志物。例如，CSF中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)水平的升高反映其在顱腦創傷研究領域的潛在作用：LPA可增強血腦屏障的通透性進而導致腦水腫和出血，并可以誘導白細胞介素(interleukin，IL)-6等炎性細胞因子的產生[24]；LPA抗體可降低LPA對腦的神經毒性和促炎癥作用，改善顱腦創傷小鼠的神經功能[24]。Abdullah等[25]采用基于LC-MS的代謝組學進行研究，發現小鼠顱腦創傷后3個月，海馬體中卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)均增加，而在皮質與小腦處減少；大腦皮層的卵磷脂及PE水平均高于小腦。卵磷脂、鞘磷脂及PE在顱腦創傷小鼠的不同腦葉中都具有其各自的區域特異性變化模式。

3.3 代謝組學在顱腦創傷患者中的應用 N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate，NAA)和乳酸鹽可能是預測顱腦創傷患者短期臨床結局的潛在生物標志物[26]。Barkhoudarian等[27]通過磁共振波譜分析技術探索中重度顱腦創傷后患者大腦代謝變化時發現，血清NAA/蛋氨酸比值與GCS評分呈正相關，與傷后3個月格拉斯哥預后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)評分呈負相關；血清乳酸/蛋氨酸比值與GCS評分呈負相關，與傷后3個月GOS評分呈正相關。乳酸是顱腦創傷后早期反映神經軸索損傷的生物標志物，可用于顱腦創傷嚴重程度和結局的預測；而NAA為神經元滲透代謝物、脂質和髓磷脂生物合成的前體，其并非顱腦創傷特異性生物標志物，肌萎縮側索硬化癥、多發性硬化癥和血管性癡呆亦會引起NAA升高[28]。有學者采用磁共振氫譜技術檢測顱腦創傷患者的CSF，發現其乳酸、丙二醇、谷氨酰胺及肌酐水平明顯升高，而丙二醇與腦水腫密切相關，乳酸和丙二醇是氧代謝率、顱內壓和GOS評分的強預測因子[29]。

代謝物-生物標志物檢測亦有助于顱腦創傷嚴重程度分類。Jeter等[30]使用GC-MS和LC-MS比較健康者和顱腦創傷患者的血漿代謝物，結果顯示，與健康者相比，重度顱腦創傷患者的血漿主要代謝產物如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和特異性代謝產物異丁酰肉堿、3-甲基-2-氧代戊酸、丙酰肉堿和異戊酰肉堿水平均明顯降低，甲基戊二酰肉堿水平也降低；與健康者相比，輕度顱腦創傷患者血漿纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平降低，而丙酰肉堿水平增加。這提示支鏈氨基酸代謝的改變可能影響顱腦創傷患者的能量代謝、蛋白質和神經遞質合成。Jeter等[30]還發現，異亮氨酸和亮氨酸與顱內壓升高(≥25 mmHg)密切相關，丙酸肉堿、2-甲基丁酰肉堿、4-甲基-2-氧代戊酸酯是顱內壓升高的獨立危險因子；而其采用非靶向LC-MS分析尿液代謝組學進行研究，發現有3 897項代謝指標有助于重度顱腦創傷的診斷。

Ottens等[31]應用串聯質譜揭示了急性康復期后重度顱腦創傷患者的神經發育反應和康復進展的生物學機制。該研究提示基于尿液的代謝組學是一種無創、有效的連續采樣縱向監測方式，對顱腦創傷分類具有潛在作用。Yi等[32]采用GC-MS技術對血清代謝物水平進行分析，發現中重度顱腦創傷患者與健康對照組血清中有20種代謝變化差異，其中存在認知障礙的中重度顱腦創傷患者血清絲氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺及花生四烯酸水平較健康對照組增加，丙酮酸、丙氨酸、谷氨酰胺水平較健康對照組降低(P<0.05)；無認知障礙的中重度顱腦創傷患者血清絲氨酸、苯丙氨酸、花生四烯酸和半乳糖水平較存在認知障礙的患者顯著降低(P<0.05)。這說明顱腦創傷后的認知障礙與氨基酸代謝異常及脂質代謝改變有關，基于GC-MS技術的血清代謝物檢測或可用于鑒別顱腦創傷后有無認知功能障礙。但上述研究納入病例數較少，今后仍需大樣本多中心研究予以驗證。

3.4 挑戰和技術限制 多發傷所致多種生物標志物升高可能顯著降低顱腦創傷相關代謝物-生物標志物的特異性。理想的顱腦創傷相關代謝物-生物標志物應具有高敏感性、高特異性和高準確性，且具有低假陽性和低假陰性[33]，還不應受到如性別、年齡、體質指數和種族等因素的影響[34]，其應在顱腦創傷后迅速分泌至血液或高表達，可評估損傷程度、反映病理生理學狀況并具有預后評估作用[35]。目前有關顱腦創傷相關代謝物-生物標志物的研究較少，仍需對代謝組學研究結果進行驗證以提高其可重現性和可預測性。小樣本量是低效研究的主要問題，通常出現低強度分析和過度擬合。小樣本量與患者異質性的相結合可導致數據誤解、預測能力降低和代謝標志物的選擇不正確，因此錯誤發現率可能會增加[36]。因此，使用代謝變化的效應大小進行功效分析對估計樣本量至關重要。此外，最常見的代謝組學分析手段如GC-MS、LC-MS均受基質效應、離子抑制和衍生化誤差的影響，這些均是代謝組學實驗準確性的潛在威脅。代謝變化對混雜因素(年齡、性別、體質指數、腸道微生物)和生活方式也非常敏感[37]。由于代謝物濃度將隨時間變化，故采樣時間對代謝組學分析影響也很大，因此要使用標準操作規程進行采樣，以隨機方式設置樣品進行單次分析，以避免批次導致的影響。

4 總結與展望

顱腦創傷為高度異質性疾病，目前尚無高靈敏度和特異性的單一生物標志物用于顱腦創傷的診斷或預后評估。筆者認為代謝組學有以下的優勢：可發現用于顱腦創傷患者診斷和預后評估的代謝物-生物標志物，這有助于揭示顱腦創傷潛在的病理生理學和神經生物學機制；高通量分析工具能夠識別和量化數百種代謝物；此外，由于代謝物比蛋白質、RNA及基因更不容易被剪切，因此代謝組學也可能比基因組學和蛋白質組學更省時省力。隨著個性化醫療的發展，代謝組學發現的生物標志物可促進患者個性化治療的發展，并有助于通過藥物代謝組學方法選擇最佳的治療策略。