貴州省首次報道人感染H9N2禽流感病例的病原學診斷及意義

莊麗 王恒 馮蓓 蔣琳 蔣維佳

(1.貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.黔西南州疾病預防控制中心，貴州 興義 562400)

禽流感病毒(AIV)根據致病力不同，分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。最常見的低致病性禽流感病毒是H9亞型禽流感病毒， LPAIV雖然發病率和致死率低，但廣泛存在于家禽及候鳥中，流行和傳播范圍較為廣泛[1]。人感染H9N2禽流感病例的臨床癥狀較輕，僅表現為輕微流感樣癥狀或肺炎癥狀[2]。在貴州省禽類外環境標本和候鳥糞便的Real-Time PCR檢測中，禽流感病毒H9N2亞型感染率一直保持較高水平，但在貴州省人群監測中從未發現過人感染H9N2禽流感病例，本文監測發現的人感染H9N2禽流感病例為貴州省首次報道。

1 材料和方法

1.1標本來源 貴州省流感哨點監測醫院采集符合流感樣病例定義的標本。病例定義為發熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2患者病史 杜某，女，3歲，發病前有禽類接觸史，發熱2 d就診。

1.3標本種類及采集 咽拭子：用帶有聚丙烯纖維頭的拭子適度用力擦拭雙側扁桃體及咽后壁，避免觸及舌部。將拭子頭浸入采樣液，棄去尾部。

1.4實時熒光定量(Real-Time)PCR檢測[3-5]提取試劑盒為ABI公司 RNADNA核酸提取試劑盒，具體操作步驟見試劑盒說明書。通過 Real-Time PCR方法檢測H9N2禽流感病毒。本實驗采用達安基因有限公司生產的相關試劑盒進行檢測。

1.5MDCK細胞病毒分離 準備75%～90%成片的MDCK細胞，T-25細胞瓶。在DMEM基礎培養液中加入2%青、鏈霉素母液(終濃度達：100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)；2%牛血清白蛋白組分V(終濃度：0.25%)；2%HEPES緩沖液(終濃度：25 mM)；7.5%的NaHCO3溶液(所加NaHCO3溶液體積為總體積的2%～3%)；1‰的TPCK-胰酶(母液濃度為2 mg/mL)，使TPCK-胰酶的終濃度為2 μg/mL。用PBS緩沖液清洗細胞3遍，吸取1 mL標本置于細胞培養瓶中，放入37 ℃培養箱中吸附2 h。再用PBS緩沖液清洗一遍細胞，加入6 mL病毒培養液，放入37 ℃培養箱培養。接種后每日顯微鏡下觀察細胞病變情況，第5日細胞病變超過75%，收獲。用1%紅細胞懸液對細胞培養物進行鑒定。

2 結 果

為貴州省某流感樣病例監測哨點醫院，Real-Time PCR檢測結果為通用引物陽性，CT值為32.35，禽流感病毒H9亞型陽性，CT值為33.23，N2陽性，CT值為36.58。MDCK細胞分離的H9N2亞型禽流感病毒，經紅細胞凝集試驗(HA)檢測，HA滴度為1∶16。細胞培養物的Real-Time PCR檢測結果顯示通用引物陽性，CT值為27.37，禽流感病毒H9亞型陽性，CT值為30.06，N2陽性，CT值為30.03。

3 討 論

我國已在多種禽類和其他家養動物中檢測出H9N2禽流感病毒，并發現多起人感染H9N2禽流感病例[6]。云南省某地活禽市場內宰殺和銷售禽類從業人員血清標本中H9N2中和抗體陽性率達到16%，可見人群對于H9N2禽流感病毒易感性遠高于H5N1和H7N9病毒，也就是說，一旦H9N2禽流感病毒通過變異或重組獲得高致病性，將有可能獲得與H5N1禽流感病毒一樣的傳播能力，完全可以引起流感大流行[7]。

本例患者通過病原學診斷確診為人感染禽流感H9N2病例，并成功分離出H9N2亞型禽流感病毒，為貴州省首次報道的人感染H9N2亞型禽流感病例。2014～2017年每年冬春季，均要針對貴州省某活禽市場外環境標本連續監測，標本類型包括：禽類糞便、禽類籠具表面拭子、清洗禽類用水、宰殺禽類案板拭子、禽類飲用水等。檢測結果顯示2014—2016年H9N2禽流感病毒陽性率為20%～51%，一直處于一個較高的水平。于2017年稍有下降，或與當地大規模接種禽類疫苗有關。但一直沒有發現人感染H9N2禽流感的報告。很有可能是人感染H9N2禽流感病例的臨床癥狀較輕，并未引起人們重視。本例患者發病時僅有發熱及上呼吸道癥狀，經過常規抗病毒治療，7 d后痊愈出院。

本病例確診后，根據其病毒特性，疾控部門采取準確及時有效的防控措施：隔離并消毒禽場和禽舍；對病禽進行處理，嚴禁病禽或者可疑病禽上市流通；對密切接觸者進行隔離觀察等措施，防止病毒進一步擴散。