腸道菌群及其代謝物TMAO與動脈粥樣硬化相關性的研究進展*

李莉莎 綜述，胡瓊英，熊大遷△ 審校

(1.成都中醫藥大學醫學技術學院，四川成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川成都 610072)

動脈粥樣硬化(AS)是導致心血管疾病(CAD)的主要原因之一，其與細胞內脂質的堆積、內皮細胞的炎性損傷、單核細胞的黏附聚集、血小板的高反應性以及并發癥的發生有關。腸道菌群對人體健康的維持至關重要，主要參與機體的新陳代謝和免疫反應等，能夠維持腸道結構、保持腸道屏障的完整，其組成上的改變可以導致人體對不同疾病易感性的差異，與許多人類所患的常見慢性疾病相關，包括結腸炎、糖尿病、慢性腎病、自身免疫病和CAD等[1-2]。日常膳食為人類生活所必須，食物中的營養物質包括肉堿、膽堿和甜菜堿等，在腸道菌群作用下，代謝形成三甲胺(TMA)，隨后轉化為氧化三甲胺(TMAO)[3]。越來越多的研究表明，腸道菌群參與的TMA/TMAO代謝途徑在AS發生發展進程中具有潛在的助推作用，提示TMAO可作為早期預測AS的潛在生物標志物。本文整理了腸道菌群及其代謝產物TMAO在促AS發生發展中的機制，并簡要總結了以腸道菌群作為潛在治療靶點策略的最新進展，尤其是天然藥物白藜蘆醇(RSV)在治療由TMAO升高而引起的AS中的積極作用，為之后針對個體腸道菌群的靶向治療提供新的思路和策略。

1 腸道菌群及其代謝物TMAO

腸道菌群是胃腸道特殊環境中1個數量龐大且多樣化的微生物群落。人類腸道菌群編碼基因超過500萬，包含300～3 000種不同的物種，其總數超過1013，與人體自身細胞數的比值約為 1∶1[4-5]。腸道菌群參與構成腸道黏膜屏障并發揮調節作用，控制營養物質的吸收和代謝，使宿主從膳食中獲取能量并將能量儲存在機體內，協助免疫組織的成熟，防止病原微生物的繁殖。人類腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、螺旋菌門等組成[6]。在健康人體中，厚壁菌門和擬桿菌門占細菌總數的90%以上，其組成隨時間的推移趨于相對穩定。影響腸道菌群組成改變的因素多種多樣，包括抗菌藥物的使用、病原體的感染、膳食習慣的改變等。在冠心病患者中，乳酸桿菌目以及厚壁菌門/擬桿菌門所占比例呈上升趨勢，而擬桿菌門(擬桿菌屬+普氏菌屬)則明顯下降[7]。

早期的研究證實，在AS斑塊中檢測到來自同1個體腸道中的細菌DNA[8]，說明腸道菌群能直接或間接地參與宿主AS的發生。后來的研究發現，腸道菌群組成及其代謝途徑的改變與AS的發生有著緊密的聯系。這些改變的代謝途徑包括TMA/TMAO途徑、初級和次級膽汁酸途徑、短鏈脂肪酸途徑以及過分泌脂多糖等[9-10]，尤其是TMA/TMAO途徑，作為AS和心臟代謝疾病的潛在促進劑，受到了廣泛的關注。

TMAO是一種直接存在于膳食中或者依賴于腸道菌群而產生的膳食代謝物。TMAO可直接存在于海魚類食物中，攝入的TMAO大約50%不經機體作用直接隨尿液排出，其余50%則完成代謝逆轉過程[11]，即在腸道中經TMAO還原酶轉為TMA，然后再次轉化為TMAO。此外，腸道菌群所特有的TMA裂解酶，能利用膳食中的碳源，將其轉化為TMA，隨后TMA被釋放入血液中，通過門脈循環進入肝臟，在肝臟中被肝黃素單氧化酶3(FMO3)有效地吸收并迅速代謝氧化為TMAO[3]。

膳食中肉堿、膽堿和甜菜堿是膳食通過腸道菌群作用產生TMAO的重要碳源。(1)肉堿：大量存在于紅肉及乳制品中，與體內脂肪代謝有關，肉堿有2個立體異構型，即具有生物活性的L-肉堿和無生物活性的D-肉堿。MEADOWS等[12]發現腸道菌群包括黏質沙雷氏菌和鈣乙酰不動桿菌等，能通過從L-肉堿中分離出3-氧丁酰基而產生TMA。(2)膽堿：膽堿是卵凝脂的組成部分，在蛋黃、奶酪和花生等中廣泛存在，是人類食物中常用的添加劑。膽堿能作為TMA的前體，在相關細菌酶的作用下生成TMAO。有學者在硫酸鹽還原菌的基因組中發現了一種能降解膽堿的膽堿利用基因簇，由其所編碼的甘氨酸自由基酶CutC/D，能通過使膽堿的C-H鍵斷裂而催化膽堿降解為TMA和乙醛[13]。(3)甜菜堿：甜菜堿主要存在于麥麩、麥胚和蔬菜等食物中，同時也可以在人體腸道細菌作用下，通過氧化膽堿或肉堿而被合成。WOOD等[14]發現甜菜堿可通過去甲基化，在甘氨酸甜菜堿轉甲基酶催化下生成二甲基甘氨酸，二甲基甘氨酸脫羧后被代謝為TMA，最終生成TMAO，對機體產生促AS作用。日常膳食占據了人類生活的大部分，以上這些發現都為了解膳食如何通過腸道菌群產生促AS作用提供了新的研究思路，且能依此研發具有抑制TMA/TMAO相關代謝酶類作用的靶點藥物，使針對ACD患者的個性化療法更具現實意義。

為了證實腸道菌群組成的變化及其代謝物TMAO的促AS作用，研究人員對AS易感小鼠給予膽堿刺激，顯示血漿循環TMAO水平以及相關特異性菌群比例同時增加，且各組血漿TMAO濃度與小鼠AS斑塊大小呈正相關。然而，在經過抗菌藥物處理后，發現小鼠血漿循環TMAO減少并伴隨著AS的改善[15]。相關的臨床實驗也產生了類似的結果，且在對患者使用抗菌藥物后，還發現主動脈斑塊中巨噬細胞數量的顯著減少。從這些觀察反映出，富含膽堿的食物、腸道菌群對TMAO的產生必不可少，TMAO水平的升高確實產生了促AS的作用。

2 TMAO促AS的病理機制

大量研究表明，AS發生最初主要涉及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成。隨后ox-LDL損壞血管內皮細胞造成內皮細胞功能障礙和活化，同時ox-LDL可被清道夫受體識別和內化，誘導巨噬細胞內膽固醇的積累和泡沫細胞的形成，最終導致血管AS[16]。所以，ox-LDL的形成、內皮損傷和泡沫細胞的形成是AS發生的關鍵事件[17]。此外，持續的炎性環境易使動脈硬化斑塊不穩定，斑塊一旦破裂就會釋放大量凝血物質，在血小板的協助作用下形成局部血栓，因此，血小板的高反應性也被認為是AS導致血栓的高危因素[18]。而TMAO的升高和這些病理過程都有著復雜的聯系。(1)TMAO可調節膽固醇和淄醇的代謝。肝膽固醇7α羥化酶(CYP7α1)是膽汁酸的主要合成酶，膽固醇在膽汁中的轉運需要膽汁酸的協助。因此，CYP7α1的缺乏會間接導致膽固醇在膽汁中轉運發生障礙。而TMAO的升高會使CYP7α1的表達降低，繼而縮小膽汁酸池，使膽固醇轉運受阻，在不改變總膽固醇的前提下，阻止膽固醇的外流使其在細胞內堆積[19]，形成富含脂質的巨噬細胞和泡沫細胞。(2)TMAO能激活血管內皮細胞炎性通路，誘導內皮細胞損傷。TMAO可以通過促進核因子κB通路磷酸化來促進血管炎性反應的發生[20]，包括激活絲裂原活化蛋白激酶和磷脂肌醇信號途徑。此外，BOINI等[21]和SUN等[22]發現TMAO也可以通過促進NLRP3炎性體的形成和激活，釋放炎性細胞因子白細胞介素-1β和IL-18，造成內皮細胞的炎性損傷。(3)TMAO能夠誘導單核細胞聚集。TMAO通過使血管細胞黏附分子-1表達上調，增加單核細胞的黏附性，誘導單核細胞聚集以及單核細胞與內皮細胞的黏附[20-23]，隨后單核細胞經內皮細胞在受損組織處轉變為巨噬細胞，吞噬ox-LDL繼續形成泡沫細胞，黏附堆積于小鼠主動脈壁形成AS斑塊(4)TMAO能增強血小板高反應性從而加速血栓的形成。ZHU等[24]在對4 007例受試者為期3年的前瞻性研究中，鑒定得出15類菌群與小鼠血小板高反應性相關，發現TMAO能夠通過增加胞內貯存Ca2+的釋放刺激血小板活化，多種血小板激活劑都伴隨著TMAO水平的升高而增強，包括ADP、凝血酶、膠原和再生障礙性貧血等。

在AS發生早期，由于TMAO水平的升高與細胞內脂質堆積、內皮細胞炎性損傷、單核細胞黏附聚集、血小板的高反應性等關鍵事件密切相關，所以理論上TMAO可作為心血管損傷的生物標志物，不僅可以用于預測早期AS及心血管不良事件的發生，同時也為臨床對于依賴腸道菌群治療AS的治療方法的研究提供了新的途徑。

3 治療策略

目前臨床上對于抗AS的治療方案較為單一，使用他汀類降脂藥是目前臨床上治療AS主要手段。但是他汀類藥物在沒有CAD(初級預防)人群中的使用所帶來的危害可能大于益處。所以，亟需針對性更強、安全性更高的治療AS措施。

(1)控制飲食，從代謝源頭限制肉堿、膽堿、甜菜堿等食物的攝入。(2)糞菌移植，增加功能菌群豐度。糞菌移植是將健康者體內功能完整的腸道菌群導入到患者體內，達到治療相關疾病的目的。糞菌移植的治療作用已經在諸多臨床實驗中得到證實，也為各種疾病發生時相關微生物與宿主的相互作用提供了證據，這些疾病包括艱難梭菌感染、炎性腸病、糖尿病、CAD、癌癥等[25-26]。GREGORY等[27]研究發現，AS的易感性可通過腸道微生物移植傳播。所以，臨床上通過糞菌移植術重塑患者腸道菌群可能是改善AS的有效策略。(3)研發TMA/TMAO相關代謝酶類抑制劑。有學者預測并確定了一種Rieske型加氧酶/還原酶(CNTAB)及其相關基因簇，該基因簇被認為參與了人類腸道菌群基因組中的肉堿代謝，CNTAB在腸道菌群利用肉堿代謝生成TMA的過程中發揮重要作用[28]。上文提及的膽堿特異性TMA產生酶，CutC/D，也能夠催化膽堿降解產生TMA[13]。此外，FMO3在TMA轉化為TMAO過程中發揮著不可替代的作用，MIAO等[29]通過敲除胰島素拮抗小鼠中FMO3基因，證實FMO3參與了全身膽固醇和甾醇代謝的調節。因此，可以將這些細菌代謝酶作為潛在治療靶點，通過人為干預控制相關酶，降低TMAO水平以減緩由相關膳食代謝所導致的AS發展。有趣的是，WANG等[30]在研究時發現細菌中本身存在一種TMA裂解酶抑制劑，即膽堿結構類似物3,3-二甲基-1-丁醇，它能夠通過抑制多種腸道菌群的TMA裂解酶，阻止膽堿或肉堿膳食經腸道菌群代謝生成TMAO。(4)天然藥物-RSV。RSV作為一種天然的多酚，參與了機體脂肪代謝、葡萄糖平衡，具有抗炎性反應和氧化應激等作用[31-32]。其有利于治療多種代謝紊亂性疾病，并且能通過重塑腸道菌群改善AS。CHEN等[33]在實驗中發現，0.4%的RSV治療能抑制TMA的合成，首次證明了RSV可以通過多種方式重塑腸道菌群，且其能利用調控腸道菌群的方式增加肝臟膽汁酸的合成和降低TMAO水平。RSV重塑腸道菌群包括降低厚壁菌門/擬桿菌門比率和增加益生菌的相對豐度[34]，益生菌可增加腸道膽汁酸水解酶活性，顯著上調CYP7α1的表達，促進肝臟膽汁酸的合成，最終抑制TMAO的升高，從而達到改善AS、降低CAD患病風險的目的。雖然將RSV作為一種針對性更強、安全性更高的抗AS藥物具有一定的理論基礎，然而由于其低生物利用度[35]，RSV用于臨床治療AS的有效性尚未確立，新型藥物的研發還需進一步的實驗。

因為腸道菌群對TMAO的形成至關重要，所以可以將重塑腸道菌群以及抑制TMA/TMAO途徑作為治療策略，無論是通過膳食干預、糞菌移植來改善腸道菌群益生菌屬豐度，還是研發使用相關TMA裂解酶類抑制劑以及使用具有抗AS作用的天然藥物，都有可能改善因TMAO升高導致的AS。

4 問題與展望

盡管腸道菌群及其代謝物TMAO對于AS的助推作用已經得到了很多動物模型、臨床實驗的證實，但是研究依舊面臨著許多挑戰。(1)膳食中的膽堿、肉堿和甜菜堿均能作為營養物質，增加魚肉攝入比例，也可以減輕炎性反應從而預防CAD。在一項隊列研究中，發現僅在伴有TMAO水平異常升高的群體中，膽堿、甜菜堿和肉堿水平才能預測主要不良心臟事件[31]。(2)并不是所有年齡段人群中TMAO的增高都會產生促AS作用。一組實驗對象為33～45歲成年人的前瞻性實驗表明，血漿TMAO的升高與AS進展及CAD的發病率增加無關，TMAO可能對健康的中青年早期AS的風險和進展沒有顯著的影響[32]。(3)以上提到的病理機制中，TMAO是否直接與特定受體相互作用，或是通過改變蛋白構象間接改變信號通路目前還尚不清楚，因此還需要更多的研究來發現這些靶點，以研發針對性更強的靶點藥物。

近年來，人類微生物組計劃的提出、生物信息學以及代謝組學等高通量技術的發展，使人們對腸道菌群組成及其代謝產物的改變在導致人體AS中的重要作用有了更深刻的認識，其參與的TMA/TMAO代謝途徑能以多種方式參與AS的發生發展，人們可以通過調節TMAO產生過程中的各個環節來降低TMAO水平，既而阻止AS的發生發展。然而，由于相關微生物合成酶類以及TMAO在促AS過程中的信號轉導途徑還不是十分明確，當前鑒定得出的細菌種類也比較局限，所以腸道菌群在宿主代謝過程及AS進展中的精確作用仍有待闡明。回顧以往對于腸道菌群及其代謝物TMAO與AS關系的研究，發現人們的認識相對局限，缺少從整體上(如完成整個代謝過程、人體發育的完整階段以及病程的前中后期等)結合定性乃至定量地去權衡特定膳食攝入帶來的風險是否超過益處。因此，需要大量多中心、大規模的臨床實驗以更加全面地認識腸道菌群組成的改變及其代謝過程與AS發生之間的相互作用關系，以期能發現更多的，能夠靶向產生TMAO的細菌或參與酶來證實其潛在的治療能力。