魚類精子超低溫冷凍保存技術研究進展

周 洲， 孔 杰， 趙 鳳， 蔣曉紅

(貴州省農業科學院 水產研究所， 貴州 貴陽 550025)

利用精子超低溫冷凍保存技術，將品種優良的養殖魚類及瀕臨滅絕魚類的精子冷凍保存起來，建立相應的魚類精子庫，可以避免因魚類棲息環境污染、過渡捕撈及外來物種入侵而造成的魚類資源的衰退或工廠化養殖中長期的近親交配導致的魚類種質資源退化及變異現象[1-2]，并為魚類雜交育種、雌核發育、性別控制、轉基因等生物技術研究不間斷地提供材料[3-4]。同時，魚類精子的超低溫冷凍保存可以解決魚類育種過程中的諸多實際問題，如對于大鯢、花狼魚等養殖魚類雌雄魚不同步成熟，可以利用超低溫冷凍保存的精子誘導雌魚產卵，從而實現魚類的成功繁殖[5]；可以實現性逆轉及地理隔離的養殖魚類品系得以交配，如針對黃鱔等性逆轉的個體在雜交育種中不能自然交配等遺傳育種問題，可以使用超低溫冷凍保存的精子，采取人工授精的方式，使遠緣雜交可行，促進水生動物種質資源開發與改良[6]。

魚類精子同魚卵和胚胎相比，具有體積小的特點，抗凍劑容易通過，冷凍保存較易成功。自1953年英國學者BLAXTER[7]首次成功對大西洋鯡魚(Clupeapallasi)進行冷凍試驗以來，魚類精子超低溫冷凍保存技術已有較大突破，目前已有200多種海淡水魚類精液得到成功保存，國外研究成功的魚類包括褐鱒魚(Caspianbrowntrout)[8]、日本鱘[9]、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)[10]、大西洋鮭(Salmosalar)[11]等；在我國也取得了一些成效，如黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[12-13]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[14]、白斑狗魚(Esoxlucius)[15]、真鯛(Pagrosomusmajor)[16]等。筆者從抗凍劑、緩沖液、降溫及解凍速率等方面介紹了魚類精子超低溫冷凍保存技術的研究進展，旨在給魚類種質資源保護和魚類遺傳育種研究提供參考。

1 精子冷凍保存技術的生物性原理

魚類精子排出體內后，由于外界溫度顯著高于體內，致使魚類精子加快對攜帶能量的代謝速度，又加之精子不能利用外界環境中的能量物質，從而精子存活時間很短，只有將精子放置在低溫環境下保存才能有效地延長存活時間。

魚類精子超低溫冷凍保存技術是通過選擇合適的滲透液，按照一定的稀釋比例將魚類精子稀釋后，為滿足精子在低溫冷凍保存過程中將低溫損失降低到最小(冰晶損傷、溶質損傷等)，讓精子迅速通過危險溫度區(0～-60℃)到達超低溫狀態(如-196℃的液氮等)，從而讓精子進入休眠狀態。待需要時，通過合適的解凍速率將休眠狀態的精子恢復到常溫狀態，并且保證精子具備正常的受精能力[11-13]。

2 魚類精子冷凍保存研究進展

不同種類的魚其精子的生物學特性不同，對于冷凍保存步驟、抗凍稀釋液的選用及降溫平衡等方面的要求也不盡相同。針對不同種類的魚類精子低溫冷凍保存技術展開研究，其研究內容主要包括抗凍劑、稀釋液、降溫和解凍速率等。

2.1 抗凍保護劑

抗凍保護劑由抗凍劑和稀釋液兩部分組成。不同魚類的精子對抗凍保護劑的成分和濃度要求不同，在進行超低溫冷凍保存試驗之前，大部分研究人員都會根據其生理特性進行篩選。適宜的抗凍保護劑能最大限度地減少精子損傷，起到良好的保護作用，反之則會毒害細胞。

2.1.1 抗凍劑 抗凍劑在魚類精子超低溫冷凍保存中發揮重要的作用，其可保護精子在超低溫保存過程中免受冰凍損傷(冰晶損傷、溶質損傷等)，同時可以起到調節細胞滲透壓的作用[17]。由于不同魚類精子細胞膜對不同抗凍劑的通透性不同，導致魚類對抗凍劑的選擇具有特異性。目前最常用的抗凍劑有二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PG)、乙二醇(EG)、甘油(GLY)、甲醇(MeOH)等[18]。如鱸魚(Lateolabraxjaponicus)[19]、大菱鲆(Psettamaxima)[20]、大西洋鱘(Acipensersturio)[21]和半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[17]等魚類精子選擇二甲基亞砜作為抗凍劑，凍存精子效果明顯；丙二醇和二甲基亞砜保存圓斑星鰈(Veraspervariegatus)精子，激活后精子的受精水平與鮮精相似[22]；丙二醇和乙二醇對真鯛(Pagrosomusmajor)精子都起到很好的凍存效果且無顯著差異；10%甲醇對黃顙魚精子冷凍保存有較好的保護效果[12，23]；鯉、團頭魴、草魚、鰱及鳙等5種淡水魚類選擇13% 二甲基甲酰胺(DMF)作為抗凍劑，解凍后的受精能力同鮮精相比無顯著差異[13]；花鱸[24]、大黃魚[25]選擇甘油作為抗凍劑都起到很好的凍精效果。

精子抗凍劑在保護精子免受凍傷外，還對精子具有負面作用，如二甲基亞砜會對細胞產生毒害作用，影響精子的抗凍效果以及凍精解凍后的活力等[26]。由于抗凍劑的毒性會隨著添加濃度的增加而增加，且受到添加抗凍劑的平衡時間和溫度影響，因此，選擇最適的抗凍劑時要在抗凍劑的品種和濃度上進行選擇，保證最大限度發揮其抗凍保護作用，并最大限度地降低其負面作用。為了降低抗凍劑的毒性，一般會通過優化選擇低毒低濃度的抗凍劑、降低抗凍劑同精子的平衡時間及非滲透性抗凍劑等方法來保持細胞膜的完整性。陳松林等[26]采用分步添加法成功降低了二甲基亞砜對精子的毒害作用；華澤釗等[27]研究發現，22.8% 二甲基亞砜 + 17.2%乙酞胺混合作為抗凍劑是40%(W/V)的二甲基亞砜單一抗凍劑毒性的1/3，即抗凍劑混合后使用可中和抵消部分單獨使用時的毒性。

2.1.2 稀釋液 稀釋液的選擇是精子超低溫冷凍保存的重要因素，稀釋液既是精子保存環境pH、滲透液的調節劑，又是精子能量來源的源泉[1]。與抗凍劑相比，稀釋液對精子一般沒有毒性，而且不會激活精子。稀釋液的種類較多，到目前為止還沒有一個統一的說法[28]。不同魚類精子對超低溫冷凍保存所用稀釋液的要求也不同。已用過的稀釋液成分主要有鹽類(如NaHCO3、NaCl等)、糖類(如葡萄糖、果糖等)、脂類(如磷脂)和蛋白質(如小牛血清等)以及其他添加劑(如甘氨酸、抗生素等)[2]。不同種類的稀釋液在保證精子生存環境的前提下，其成分組成越簡單越好[29]。如以HBSS液為稀釋液冷凍保存的黃姑魚精子激活率達(79.25±3.86)%～(85.25±3.95)%[30]；以D-15為稀釋液冷凍保存草魚(Ctenopharynodonidellus)和鰱(Hypophthalmich)的研究表明，其解凍激活率分別達55%和70%[1]；以D-17作為稀釋液冷凍保存鯉(Cyprinuscarpio)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)精子的研究表明，其解凍激活率可達70%以上[1]；以Cortland液為稀釋液冷凍保存的黑鯛和大黃魚精子，激活率最高，分別達(92.91±1.25) %和(89.93±1.07) %[31-32]；以Hanks’液作為稀釋液冷凍保存大黃魚(Pseudosciaenacrocea)精子的研究表明，其解凍激活率可達76.6%～80.0%[33]。

2.2 降溫、解凍速率

魚類精子能在超低溫狀態下長期保存，但是在凍存和解凍過程中容易受到損傷，如滲透壓的變化、降溫及解凍速率、凍融等引起的損傷，所以需要采用合適的速率降溫及解凍。

2.2.1 降溫速率 降溫速率會使細胞發生不同的生理變化并產生不同的損傷。當降溫速度過快時，精子細胞內的水分可能來不及代謝到細胞外，受低溫的影響而形成結晶，也就是所謂的細胞內冷凍損傷；當降溫速率過慢時，魚類精子長期放置在稀釋液和抗凍劑的溶質環境中，造成平衡時間過長，可能會導致精子外界環境pH及滲透壓的變化從而造成損傷[34]。目前，較常用的方法是二步降溫法(首先是魚類精液在4℃平衡后，將凍存管在液氮面上1～10 cm放置2～10 min，然后在液氮面上放置一段時間或者直接投入液氮中)[35]和干冰壓片法(將稀釋后的精液迅速在干冰上壓片，冷凍5 min后投入液氮中保存)，如虹鱒[36]等。也可以將魚類精子直接投放于液氮中保存，也可獲得很好的保存效果，如大黃魚[25]。

2.2.2 解凍速率 解凍速率與解凍液的初始溫度、精子與解凍液的比例、精子的體積和水浴的溫度均有密切關系，即冷卻降溫與解凍復蘇的速率要相適應，需經歷相似過程。同降溫過程相似，解凍過程也會受到凍損，可能造成精子細胞內的水分形成重結晶[1]。目前常用的方法是水浴，絕大部分研究均以25～30℃水浴解凍[37]。對于解凍速率已開展了很多研究，但不同魚類精子適用的解凍速率不同[38]。林丹軍等[25]用室溫(21～25℃)解凍法解凍大黃魚的效果良好；KEBBY等[39]采用快速解凍(50～60℃)條紋狼鱸精子，其解凍效果與慢速解凍無顯著差異。西伯利亞鱘[40]及紅擬石首魚(Sciaenopsocellata)[41]精子在不同的降溫步驟及不同的水浴復蘇溫度下表現出相似的精子活力。

2.3 精子活力檢測

目前的超低溫冷凍保存技術研究大多采用精子活力來判斷凍存效果，但不同的檢測方法得到的結果不一致，導致目前尚未建立統一的精子活力標準。國內外最常用的精子活力檢測方法是計算機輔助活力分析(CASA)，目前已被廣泛用于分析庸鰈(HippoglossushippoglossusL.)[42]、斑鱖(Sinipercascherzeri)[43]、斑馬魚(Pteroisvolitans)[44]等的精子活力。精子活力檢測發生在冷凍保存的精子在解凍激活后的很短時間內，因此要在短時間內檢測出精子的各種活力指標存在難度。周磊等[44]研究斑鱖精子冷凍保存試驗表明，將顯微鏡觀察和計算機輔助活力分析(CASA)配合使用比獨立使用其中一種檢測方法得出的精子活力值更具有說服力。

3 小結與展望

魚類精子冷凍保存技術在保護物種多樣性上的應用前景廣泛，諸如魚類冷凍精子庫的建立、雜交育種、雌核發育、性逆轉等。但是魚類精子超低溫冷凍保存的過程很復雜，魚類精子需要經過pH及滲透壓變化、降溫及解凍過程及細胞脫水結晶等內外環境的變化。魚類精子凍存解凍受到的損傷必然導致激活后授精能力的下降。如何既能發揮超低溫冷凍保存技術的優點，又對魚類精子造成的傷害同鮮精相比差異較小是國內外學者共同研究的方向，這就要求對超低溫冷凍保存技術的各個環節進行篩選優化，摸索建立不同魚類可重復、成本低的精子超低溫冷凍保存技術體系。