表皮生長因子協同體預處理對大鼠腦缺血再灌注的保護作用

渠靜 許娜 奧婷 張君 張芹 肖淑英 張瑞華

[摘要] 目的 探討表皮生長因子協同體（EGF-c）預處理對大鼠腦缺血再灌注（IR）的保護作用及其相關機制。 方法 將30只雄性SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組（sham組）、缺血再灌注組（IR組）及EGF-c預處理+IR組（EGF-c組）。采用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO）。術后24 h，應用2%氯代三苯基四氮唑（TTC）染色法檢測腦梗死體積，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測高遷移率族蛋白1（HMGB1）的表達。 結果 與sham組比較，IR組腦梗死體積增大（P < 0.01），SOD活性降低（P < 0.01），MDA和HMGB1的含量增加（P < 0.01）。與IR組比較，EGF-c組腦梗死體積減小（P < 0.05），SOD活性上升（P < 0.01），MDA含量下降（P < 0.01），HMGB1的表達量下降（P < 0.05）。 結論 EGF-c預處理可能通過改善腦組織SOD活性、降低MDA含量、下調HMGB1的表達從而對大鼠IR起到保護作用。

[關鍵詞] 表皮生長因子協同體;腦缺血再灌注;超氧化物歧化酶;丙二醛;高遷移率族蛋白1

[中圖分類號] R743.31? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（b）-0008-05

[Abstract] Objective To study the effect of epidermal growth factor-coordination （EGF-c） on cerebral ischemia reperfusion （IR） in rats as well as its mechanism. Methods Thirty male SD rats were divided into sham group， ischemia reperfusion group （IR group）， EGF-c pretreatment and IR group （EGF-c group） by random number table method. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model of rats was made by suture method. 24 hours after operation， the cerebral infarction volume was detected by 2% triphenyl tetrazolium chloride （TTC） staining， the activity of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA） in brain tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， the expression of high mobility group protein 1 （HMGB1） was examined by Western blot. Results Compared with sham group， the infarction volume was increased （P < 0.01）， the SOD activity was decreased （P < 0.01）， the contents of MDA and HMGB1 were increased in IR group （P < 0.01）. Compared with IR group， the infarction volume was decreased （P < 0.05）， SOD activity was increased （P < 0.01）， the content of MDA was decreased （P < 0.01）， the expression of HMGB1 was decreased in EGF-c group （P < 0.05）. Conclusion EGF-c pretreatment may play a protective effect on IR of rats by improving the SOD activity， decreasing the content of MDA and the expression of HMGB1.

[Key words] Epidermal growth factor-coordination; Cerebral ischemia reperfusion; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; High mobility group protein 1

缺血性腦卒中呈現發病率高、致殘率高和病死率高的特點，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。近年來大量研究表明，自由基和炎性反應在缺血性腦卒中的病理過程中發揮重要的作用[1-4]。缺血性腦卒中的大鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）和高遷移率族蛋白1（HMGB1）的表達升高[5-7]。目前，缺血性腦卒中的二級預防主要包括抗血小板和控制血壓、血糖等危險因素，但此病的臨床結局仍不理想[8-9]。因此，探索其他切實可行的干預措施是當前亟待解決的問題。表皮生長因子（EGF）是由53個氨基酸殘基組成的小肽，可調節細胞生長、增殖和分化，近年來研究發現EGF在腦梗死后腦保護方面發揮積極作用[10-11]。肝素結合表皮生長因子是EGF家族成員，它可以減少MCAO大鼠的腦梗死體積，減少氧自由基以及氧化物的產生[12-14]。但EGF活性只能保持1周，從而為EGF的臨床轉化帶來了困難。表皮生長因子協同體（EGF-c）是由毛葉絞股藍萃取物與EGF融合而成，使EGF的活性保持時間顯著延長，解決了EGF活性保持時間短這一難題[15]。EGF-c與EGF具有相同的生物學功能，因此本研究用EGF-c代替EGF，探討其是否對大鼠IR有保護作用，并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只雄性SD大鼠，290～310 g，購自北京維通利華實驗技術有限公司[SCXK（京）2009-003]。

1.2 儀器與試劑

倒置顯微鏡（Nikon公司，型號：ECLIPSE TS100）;臺式低溫離心機（Sigma公司，型號：3K15）;手術顯微鏡（Leica公司，型號：M525）;激光多普勒儀（Perimed公司，型號：PeriFlux 5000）;全自動酶標儀（美國Biotek公司，型號：ELx808）。

2%氯代三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：G3005）;大鼠SOD和MDA的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：m1540172、m1548189）;HMGB1兔單克隆抗體（美國abcam公司，批號：ab79823）;β-actin鼠單克隆抗體（北京冠星宇科技有限公司，批號：G1001）;二抗（北京索萊寶生物科技有限公司;批號：SE131、SE134）。

1.3 動物分組和模型的建立

將大鼠按隨機數字表法分為三組：假手術組（sham組）、缺血再灌注組（IR組）和EGF-c預處理+IR組（EGF-c組）。EGF-c組于腦IR前連續每日腹腔注射EGF-c 20 μg/kg，共5 d。IR組和EGF-c組采用Zea-Longa法制備MCAO模型。手術過程如下：大鼠麻醉后仰臥位固定，行頸正中切口，分離肌肉及筋膜，暴露右側頸總、頸外和頸內動脈。暫時夾閉頸內動脈，近心端結扎頸總和頸外動脈。在距頸總動脈分叉部4 mm處剪一小口，將栓線插到頸內動脈，當插入深度為18 mm時，系牢頸總動脈遠心端的細線，縫合傷口。缺血2 h后將栓線拔出實現再灌注。造模成功標準[16]：術后12 h以Longa神經學評分在1～4分為造模成功。本研究通過首都醫科大學附屬北京潞河醫院醫學倫理委員會批準。

1.4 腦梗死體積的測定

IR 24 h后，麻醉大鼠，取腦組織并將其切成6個冠狀切片，置于TTC溶液中染色，隨后用4%多聚甲醛固定，用ImageJ 1.42軟件加以分析。大腦梗死體積百分比由以下公式計算：梗死體積比=梗死體積/總體積×100%。

1.5 腦血流監測

大鼠麻醉后俯臥位固定，沿著頭皮正中切開，用H2O2去除骨膜及顱骨表面的脂類，暴露前囟和顱骨。在前囟后2 mm、右側旁開5 mm處，用顱骨鉆將顱骨磨薄（不能鉆透）。用激光多普勒儀監測血流。

1.6 SOD活性和MDA含量的測定

IR 24 h后，將大鼠麻醉后用生理鹽水進行灌注，取其缺血側腦組織，勻漿提取蛋白。根據實驗說明書進行操作，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測SOD活性和MDA含量，每個樣本設3個復孔。

1.7 HMGB1蛋白的測定

取大鼠缺血側腦組織勻漿提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，每孔加入10 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將電泳物轉置硝酸纖維膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后進行一抗（抗HMGB1抗體1∶10 000;抗β-actin抗體1∶2000）于4℃過夜孵育，隨后二抗（1∶10 000）于室溫孵育1 h，自動曝光，使用ImageJ 1.42軟件進行分析，結果以各目的蛋白與β-actin的灰度比值表示。

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦梗死體積的比較

與sham組比較，IR組腦梗死體積增大（P < 0.01）;與IR組比較，EGF-c組腦梗死體積減小（P < 0.05）。

2.2 各組腦血流的比較

IR組與EGF-c組大鼠腦血流較sham組大，EGF-c組腦血流較IR組小，提示EGF-c預處理可以改善大鼠IR后的腦血流。

2.3 各組SOD活性以及MDA含量的比較

與sham組比較，IR組SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P < 0.01）;與IR組比較，EGF-c組SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P < 0.01）。

2.4 各組HMGB1含量的比較

與sham組比較，IR組HMGB1含量顯著升高（P < 0.01）;與IR組比較，EGF-c組HMGB1含量降低（P < 0.05）。

3 討論

研究表明，自由基在IR損傷的病理過程中發揮重要的作用。正常體內自由基生成與清除呈動態平衡，IR時生成大量的自由基，使腦內脂質過氧化作用加強，導致神經元壞死，加重腦組織水腫[17]。針對這一病理機制，尋找有效的自由基清除劑，阻止神經細胞毒性物質對神經元的損害，是實施腦保護治療、改善IR預后的重要措施之一。本研究顯示EGF-c預處理可以減少腦梗死體積，升高SOD活性，降低MDA含量，下調HMGB1的表達，從而對大鼠IR發揮保護作用。

IR損傷的機制較多，其中炎性反應是重要因素[18]。在炎性反應晚期，腫瘤壞死因子-α等細胞因子可促進HMGB1的釋放，加重腦組織損傷[19]。研究發現，IR患者血漿中HMGB1表達明顯高于正常人群，HMGB1的升高參與并擴大了炎性反應[19-25]。在自閉癥兒童的血清中，EGF含量降低，HMGB1含量升高，二者呈負相關[26-29]。本研究發現IR組HMGB1的表達明顯高于sham組，EGF-c組HMGB1的表達明顯低于IR組，提示HMGB1參與了IR的過程，并且EGF-c可能通過降低HMGB1的釋放從而減少IR后的損傷。

SOD是細胞內主要的自由基清除劑，能清除氧自由基從而抵抗其對細胞造成的損傷。MDA是細胞膜脂質氧化后的產物之一，其含量間接反映自由基含量及脂質過氧化程度。有研究表明，肝素結合表皮生長因子可以減少氧自由基及氧化物的產生[12-13]。本研究發現EGF-c預處理后SOD活性升高，MDA含量降低，提示EGF-c可能通過提高抗氧化酶活性，降低氧化應激產物，從而減少IR后的損傷。

綜上所述，EGF-c能減輕脂質過氧化反應，提高SOD活性，降低MDA和HMGB1含量，對IR損傷具有明顯的保護作用，在臨床轉化方面具有一定潛力。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：張瑜杰）