胃炎康方對慢性非萎縮性胃炎患者胃泌素相關基因調控通路影響

彭艷紅 蔣亦昕 白光 王慶峰

摘要：目的 ?采用網絡藥理學預測胃炎康方的作用靶點，以臨床樣本驗證該靶點的準確性，確定胃炎康方的分子機制。方法 ?采用隨機數字表法將112例慢性非萎縮性胃炎患者分為治療組和對照組各56例。對照組采用西醫常規治療;治療組予胃炎康方，每日1劑，水煎，每日2次口服。2組均連續治療4周。分析2組臨床療效。采用生物信息學手段挖掘胃炎康方潛在調控基因，預測其作用于胃炎的靶點。應用免疫組化法分析胃部組織樣本以驗證胃炎康方的作用機制。結果 ?治療組總有效率為87.5%（49/56），對照組為78.6%（44/56），2組比較差異無統計學意義（P>0.05）。胃鏡顯示2組胃部病理學結構均好轉，差異無統計學意義（P>0.05）。通過網絡藥理學對胃炎康方作用的靶基因進行預測，其胃泌素相關的靶基因包括前列腺素G/H合成酶2、B細胞κ輕肽基因增強子抑制因子、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ及前列腺素F2α受體。并預測胃炎康方可基由PTGS2→IKBKB的信號通路，抑制胃泌素所致的炎癥反應。通過胃炎康方治療的臨床樣本分析，基本驗證以上推論。結論 ?胃炎康方通過對PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR等靶基因的調控激活相應信號通路而發揮治療作用。采用網絡藥理學手段可快速預測復方作用靶點，應用該方法可解釋復方對相關疾病的治療機制，并提供新的研究手段。

關鍵詞：網絡藥理學;生物信息學;慢性非萎縮性胃炎;基因靶點;信號通路

中圖分類號：R259.733.1 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0042-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.010

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?Abstract： Objective To predict the targets of Weiyankang Prescription by means of network pharmacology; To verify the accuracy of the targets with clinical samples to determine the molecular mechanism of Weiyankang prescription. Methods Totally 112 cases of chronic non-atrophic gastritis were divided into treatment group and control group， with 56 cases in each group. The control group was treated with Western medicine， and the treatment group was given Weiyankang Prescription， one dosage a day， decoction， orally twice a day. All were treated continuously for 4 weeks. The bioinformatics method was used to mine the potential regulatory genes of Weiyankang Prescription and predict its target in the treatment of gastritis. The gastric tissue samples were analyzed by immunohistochemistry to verify the mechanism of Weiyankang Prescription. Results The total effective rate was 87.5% （49/56） in the treatment group and 78.6% （44/56） in the control group， without statistical significance （P>0.05）. Gastroscopic examination showed that the pathological structure of the stomach in both groups improved， without statistical significance （P>0.05）. The target genes of Weiyankang Prescription were predicted by network pharmacology. The gastrin-related target genes included： prostaglandin G/H synthetase 2， B cell kappa light peptide gene enhancer inhibitor， phosphatidylinositol-3 kinase catalyzes the subunit δ and prostaglandin F2α receptor. It was predicted that Weiyankang Prescription could inhibit the inflammatory response caused by gastrin by the signal pathway of PTGS2→IKBKB. Through the analysis of clinical samples of Weiyankang Prescription treatment， the above inferences were basically verified. Conclusion Weiyankang Prescription can activate the corresponding signal pathway by regulating the target genes of PTGS2， IKBKB， PIK3CD and PTGFR， to realize the treatment of chronic gastritis. The use of network pharmacology can quickly predict the target of the compound acting on the disease. This method provides a new means to explain the therapeutic mechanism of compound prescription for related diseases.

?Keywords：network pharmacology; bioinformatics; chronic non-atrophic gastritis; gene targets; signal pathway

慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis，CNAG）表現為胃部黏膜處慢性炎癥細胞浸潤，并未伴隨胃黏膜萎縮性病變，僅影響胃黏膜表層上皮，未至胃黏膜深處腺體。CNAG日久會導致萎縮性胃炎，引發胃黏膜固有腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生等，增加進一步癌變的風險。CNAG發病機制目前尚不明確，其發病原因與幽門螺桿菌（Hp）感染，膽汁反流，血管活性因子、細胞因子失調及免疫相關因素等有關^[1]。該病分子靶點涉及血管活性腸肽^[2]、趨化因子10^[3]，及白細胞介素（IL）-11^[4]等。林志強等^[5]研究表明，TLR信號通路在CNAG發病過程中具有調控作用。胃炎康方為遼寧中醫藥大學附屬醫院（以下簡稱本院）院內制劑，功效疏肝泄熱、和胃止痛。為探討該方改善胃部炎癥的路徑，本研究對胃炎康方進行網絡藥理學分析，獲取其潛在作用靶點，并通過string數據庫找到同上述潛在靶點相關的互作基因，并檢測胃黏膜樣本，明確上述基因的調控情況，以探究胃炎康方作用機制。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

選擇本院消化內科2017年1月-2018年1月CNAG患者112例，采用數字隨機表法分為對照組和治療組各56例。對照組男性36例，女性20例，平均年齡48.6歲;治療組男性31例，女性25例，平均年齡49.2歲。2組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經由本院倫理委員會審查批準[2017028ND（KT）-031-07]。

1.2? 診斷標準

參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》^[6]及《慢性胃炎內鏡的分型分級標準及治療的試行意見》^[7]確定診斷標準。①病程較長，且均呈現各種程度的胃脘脹痛;②胃部感覺脹滿，厭食，餐后出現惡心反酸;③內窺鏡確診胃部炎癥，目鏡下可見胃部黏膜有紅斑、黏膜皺襞變平甚至消失，胃部黏膜水腫或有滲出，可見血管透出;④胃部經內窺鏡確認，無萎縮癥狀發生。

1.3? 排除標準

①伴胃部萎縮性病變者;②3個月內出現消化系統感染者;③存在其他免疫系統疾病史者;④伴癌癥、器官衰竭等嚴重疾病者;⑤伴精神疾病及不愿配合本研究開展者。

1.4? 治療方法

對照組采用常規西醫治療（克拉霉素、奧美拉唑、曲昔匹特）。治療組予胃炎康方（黃連10 g、蒲公英15 g、梔子15 g、黃芩10 g、佩蘭10 g、佛手10 g、陳皮10 g、砂仁10 g、白術10 g、甘草5 g，本院藥劑科制備），水煎服，每日1劑，每日2次口服。2組均治療4周。

1.5? 療效標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》^[8]制定。臨床痊愈：臨床癥狀體征消失，胃鏡復查及病理組織活檢證實黏膜慢性炎癥明顯好轉達輕度;顯效：臨床主要癥狀體征消失，胃鏡復查及病理組織活檢證實黏膜慢性炎癥好轉;有效：主要癥狀、體征明顯減輕，胃鏡復查及病理組織活檢證實慢性炎癥減輕1個級度以上;無效：臨床癥狀無改善，胃鏡復查及病理組織活檢證實黏膜慢性炎癥無變化或加重。

1.6? 網絡藥理學分析

根據藥物的君臣佐使構成，將胃炎康方分為4個簇（cluster）。cluster1為君藥蒲公英、梔子;cluster2為臣藥黃連、黃芩、佩蘭、佛手;cluster3為佐藥陳皮、砂仁、白術;cluster4為使藥甘草。以BATMAN- TCM數據庫對胃炎康方進行模擬以獲得其作用靶點，其中，設定劃界分數為20，P值為0.05。根據BATMAN-TCM數據庫所獲得的數據挖掘結果，對所獲得的靶基因進行KEGG及GO分析，推測其對應的疾病/基因/信號通路信息，并進一步進行功能富集。

1.7? 靶基因及信號通路驗證

PTGS2（abcam公司，Anti-COX2/Cyclooxygenase2抗體，兔單克隆抗體，批號ab21704），IKBKB（abcam公司，Anti-IKKα+IKβ抗體，兔單克隆抗體，批號ab178870），PIK3CD（天津賽爾生物技術有限公司PIK3CD抗體，兔單克隆抗體，批號SRP01115），PTGFR（abcam公司Anti-PTGFRN抗體，兔多克隆抗體，批號ab224392）。

患者治療前后經內窺鏡取胃黏膜組織，首先進行樣品預處理，常規免疫組化法進行測定^[9]。組織冷凍切片后，常規二甲苯脫蠟，水化;3%H₂O₂處理15 min封閉內源性的過氧化物酶，5%山羊血清處理30 min封閉非特異性結合位點;以抗體進行孵育，稀釋比例1∶100，過夜。再按說明書選用對應的免疫組化檢測試劑孵育，常規DAB染色，蘇木精復染，脫水透明后封片。免疫組化染色結果判定^[10]：隨機抽選片內5個高倍視野（×400）進行觀察，無染色陽性細胞計0分，染色陽性細胞百分率<10%計1分，10%～50%計2分，>50%～80%計3分，>80%計4分。根據多數陽性細胞呈現的染色強度計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。病理閱片及染色積分判定由2名病理醫師采用雙盲評估法觀察完成。計算染色強度積分與陽性細胞百分率積分的乘積，<6分判為低表達，≥6分判為高表達^[11]。

1.8? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 2組臨床療效及胃鏡結果比較

2組總有效率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

胃鏡顯示，2組患者治療前胃鏡下見黏膜皺襞變平甚至消失，黏膜紅白相間，以白色為主，可見血管透出，炎癥反應明顯。2組治療后患者胃部病理學結構均有好轉，可見炎癥好轉或消失，血管無透出，黏膜皺襞恢復。

2.2? 胃炎康方靶基因及信號通路預測

胃炎康方君臣佐使4個簇中，重疊的靶基因共計254個。進一步對所獲得的數據進行分析，以確定其改善胃炎癥狀的信號通路。

最終推知胃炎康方作用于CNAG的主要靶點集中在以下方面。①炎癥抑制：主要基于核因子-κB（NF-κB）信號通路，調控的靶點為基因IL-1β→NF-κB;②Hp所致胃炎機制調控：主要基于對IL-1β的調控作用;③胃泌素調控通路^[13]：主要基于PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR基因實現對胃酸分泌抑制的調控。其基因互作關系（string數據庫），預測作用于胃泌素信號通路的方式（OmicsNet數據庫）。

2.3? 臨床樣本驗證

選擇部分患者胃黏膜組織進行HE染色，依據全部的觀察組染色片，對PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR基因在治療組治療前后的高表達情況制作維恩圖。

治療前2例患者的4個對應靶基因均呈現高表達狀態。有患者亦出現了3個或2個靶基因重疊高表達狀態。表明所選定的靶點基因與CNAG高度相關。治療后患者臨床癥狀好轉，靶基因表達大幅下降，在患者組織樣本內呈現低表達或表達抑制，未出現3個或4個靶基因重復高表達，2個以上靶基因重復高表達的樣本也大幅降低（由15例降低至3例）。治療后，PIK3CD、PTGFR表達均大幅下降，僅1例患者呈現PIK3CD高表達（治療前為15例），2例患者呈現PTGFR高表達（治療前為22例）。

3? 討論

CANG為胃黏膜上皮遭受反復損害導致固有腺體的減少，或伴纖維替代腸腺化生和/或假幽門腺化生。發病過程為正常胃黏膜→Hp感染→急性Hp感染→慢性Hp感染→非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內瘤變^[13]，可見，Hp參與了關鍵環節。人體感染Hp后，胃泌素生成明顯增加，刺激胃酸分泌^[14]，從而誘發/加重胃炎癥狀。故治療上除根除Hp外，還應阻遏胃泌素誘發胃部炎癥反應。

本研究顯示，患者胃部病理學特征明顯改善。為了進一步確定其作用機制，我們應用網絡藥理學手段對胃炎康方進行分析。基于結果預測可知，胃炎康方直接抑制炎癥，或基于IL-1β分子抑制Hp所致的胃部炎癥。根據臨床樣本免疫組化結果可知，胃炎康方主要作用于PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR。PTGS2為雙功能酶，作為前列腺素內氧化酶還原酶，具有環氧化酶和過氧化氫酶活性，可催熟花生四烯酸轉化為前列腺素，在胃炎發病的過程中常同胃泌素表達呈正相關。有研究顯示，隨著Hp的感染與刺激，患者體內胃泌素不斷分泌^[15]，PTGS2在胃部組織內表達亦會上調^[16]，從而增加組織內前列腺素含量，誘發炎癥反應。從OmicsNet及string數據庫的預測結果可以看出，作為PTGS2的下游蛋白，IKBKB的表達會隨著PTGS2表達上/下調而上/下調。二者相關性亦在巨噬細胞的藥物實驗中得到驗證^[17]。

IKBKB是復合物中介導NF-κB活化經典途徑的關鍵上游蛋白^[18]，NF-κB又介導后續的炎癥反應。PIK3CD同上游蛋白的IKBKB互相作用，雖并未在胃炎患者的人體內證實，但二者密切相關，常出現于胰島素代謝異常的患者體內^[19]。研究顯示，PIK3CD在胃癌的發病過程中起到了重要作用，常在胃癌患者的癌旁組織內過表達^[11，20-21]。而且，其在消化系統癌患者的發病過程中與IKBKB的表達存在相關性^[22]。本研究顯示，雖然在患者體內IKBKB表達出現異常，僅2例出現PIK3CD高表達異常，且治療后均呈現明顯下調趨勢。由此推測，IKBKB→PIK3CD在萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內瘤變的階段發揮了重要作用。

同IKBKB→PIK3CD類似，PTGFR表達仍較低，PTGFR的過表達常出現于腫瘤或炎癥患者，其可通過ROCK途徑參與膽管等器官纖維化過程^[23-24]。其上游啟動子為COX等酶類。在本研究中，PTGS2與PTGFR的表達關系密切。可以推測，隨著萎縮性胃炎的發生，PTGS2會進一步上調PTGFR，發生胃壁纖維化，從而介導后續的腸上皮化生。鑒于本研究僅以CNAG患者為樣本進行研究，無法確認PIK3CD及PTGFR與患者胃炎發病分級間的相關性，其相互關系尚需進一步研究。

綜上所述，胃炎康方可顯著下調患者黏膜PTGS2、IKBKB表達，進一步調節二者下游PIK3CD、PTGFR，由此改善患者胃炎癥狀。

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