基于均勻設計法的附子與甘草配伍減毒研究

賈真 劉艷彥

摘要：目的? 觀察附子、甘草不同配伍比例對附子毒性的影響，探索甘草與附子配伍減毒的最佳比例。方法 ?使用均勻設計表確定附子、甘草的配伍比例;以小鼠死亡率為指標進行附子、甘草不同配伍比例急性毒性評價;多元線性回歸分析得到多元函數模型，針對函數模型求偏導數，得到附子、甘草最佳配比;比較附子及最佳配比附子、甘草的急性毒性，驗證其減毒效果。結果? 隨著甘草劑量增加，小鼠死亡率整體呈下降趨勢。針對多元回歸分析得到的多元函數模型求偏導數得附子、甘草最佳配比為0.42∶1。附子半數致死劑量為30.9 g/kg，附子、甘草最佳配比最大耐受量為100 g/kg，小鼠死亡率為20%，附子毒性明顯減小。結論? 附子、甘草配伍比例對附子毒性有一定影響，從整體趨勢來看，隨著甘草劑量的增加，附子的毒性逐漸越小。

關鍵詞：附子;甘草;配伍;均勻設計法;小鼠

中圖分類號：R284.1;R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0069-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.015

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Abstract： Objective To observe the effects of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma on toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata; To explore the best compatibility ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. Methods The compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were confirmed with uniform design method. Based on the mortality rate of mice， the acute toxicity of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was evaluated; Multiple linear regression analysis was used to obtain multivariate function model. Partial derivative for function model was used to obtain the best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; acute toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were compared， and its attenuation was verified. Results With the increase of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma dosage， the mortality rate of mice was decreasing as a whole. The best ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma obtained through partial derivative of multiple function model was 0.42：1. The lethal dosage of half Aconiti Lateralis Radix Praeparata was 30.9 g/kg. The maximal tolerable dose of best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was 100 g/kg. The mortality rate of mice was 20%. The toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata decreased significantly. Conclusion The compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma has certain effects on the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata. From the overall trend， as the dosage of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma increases， the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata is smaller.

Keywords： Aconiti Lateralis Radix Praeparata; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; compatibility; uniform design; mice

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效^[1]，是中醫治療急癥重癥的代表藥。但附子有大毒^[2]，通過炮制、久煎等方法可降低其毒性。現代藥理研究表明，附子化學成分中烏頭類生物堿是附子產生毒性作用的主要成分，同時也是發揮藥效的主要成分，炮制和久煎都會不同程度損失附子有效成分^[3-6]，從而影響療效。通過查閱古今文獻，我們發現附子常與甘草配伍使用，且甘草可使附子減毒存效。近年來，附子、甘草配伍的作用機制也成為研究熱點，包括對附子配伍甘草前后的化學成分、毒性、藥效、相態、代謝等研究^[7-15]，但關于附子、甘草配伍的作用機制仍未有定論。研究顯示，附子、甘草不同配伍比例對藥效有一定影響，從而推斷附子、甘草配伍的作用機制與用藥劑量和二藥配伍比例有關。關于附子、甘草配伍比例對附子毒性影響的研究表明，隨著甘草比例的增加，附子的毒性越來越低^[9，14]，但這些研究的配伍比例都是根據歷代醫家經驗設計。均勻設計是基于試驗點在整個試驗范圍內均勻散布、從均勻性角度出發的一種試驗設計方法，該方法試驗次數少且均有代表性，因素的水平可多設，且實驗結果可用計算機處理，在尋找最佳實驗條件、最佳配比等方面是選擇優化條件的有力工具^[16]。在中藥方面的應用包括藥理研究和優化中藥的提取工藝、制劑的成型工藝、組方配伍等^[17]。如王英豪等^[18]采用均勻設計法得出鉤吻和玉葉金花的最低毒性配伍比例。因此，本研究結合臨床用藥經驗，以及附子、甘草的急性毒性評價結果，確定附子和甘草的劑量范圍，使用均勻設計表確定附子、甘草不同配伍比例，以小鼠灌服藥液后的死亡率為指標，觀察附子、甘草不同配伍比例對附子毒性的影響，并采用多元線性回歸分析探索附子與甘草的最佳配比。

1? 儀器、試藥和動物

FA2204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司），RV10 basic 旋轉蒸發儀（德國IKAIKA公司），DLSB-5L/10低溫循環冷卻泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。白附片（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號YPA7H0001），甘草（廣州至信中藥飲片有限公司，批號17080），甲醇（色譜純，廣州飛恩新材料科技有限公司），三乙胺（分析純），水為蒸餾水。

ICR小鼠210只，SPF級，18～22 g，雌雄各半，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2013-0034。飼養于清潔級動物房，室溫20 ℃，自由攝食飲水，隔日換墊料。

2? 方法與結果

2.1? 干浸膏制備

取藥物飲片適量，置于圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取2次合并。用旋轉蒸發儀（水浴鍋溫度為70 ℃）濃縮至一定程度，轉至蒸發皿，水浴（70 ℃）加熱蒸干，得干浸膏，稱重，置于4 ℃冰箱保存備用。

2.2? 附子、甘草急性毒性評價

2.2.1? 附子半數致死劑量測定

2.2.1.1? 預試驗

ICR小鼠16只，雌雄各半，隨機分為4組，每組4只，按0.4 mL/10 g體質量計算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻觀察小鼠出現的毒性反應并記錄死亡數，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量的所在范圍。預試驗結果表明，附子組無死亡劑量為10 g/kg，全致死劑量為80 g/kg。

2.2.1.2? 正式試驗

ICR小鼠36只，雌雄各半，適應性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為6組，每組6只，根據預試驗結果確定各組給藥劑量，組間距為0.6。按0.4 mL/10 g體質量計算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻開始觀察小鼠神經系統、循環系統、消化系統的毒性反應，記錄中毒潛伏期、開始出現死亡的時間、各組小鼠死亡數等，及時解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。繪制小鼠死亡曲線，采用Bliss法計算半數致死劑量（LD₅₀）。

2.2.1.3? 小鼠中毒癥狀及附子半數致死劑量測定結果

小鼠給藥后出現身體顫抖、惡心干嘔、行動遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動、俯臥不動。死亡前全身顫抖、怠動無力、呼吸急促，部分小鼠出現驚厥。動物死亡多發生在給藥后0～4 h內，對死亡動物進行解剖，發現肝臟邊緣發黃或發黑，部分小鼠脾臟或者心臟略有發黑。給藥24 h后無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復正常狀態。不同劑量引起小鼠死亡數見表1，附子LD₅₀為30.9 g/kg，95%置信區間為21.4～45.1 g/kg。

2.2.2? 甘草最大耐受量測定

2.2.2.1? 預試驗

ICR小鼠10只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質量計算灌胃體積。以最大濃度0.75 g/mL甘草灌胃1次，觀察7 d，無死亡出現。

2.2.2.2? 正式試驗

ICR小鼠40只，雌雄各半，隨機分為對照組和給藥組，每組20只，計算灌胃體積，給藥組1 d內給予最大給藥量（0.75 g/mL×0.4 mL/10 g），對照組給予等體積水，灌胃3次。觀察7 d，測定最大耐受量（MTD）。小鼠給藥后未出現異常活動，解剖結果也未見異常情況。實驗結果顯示，甘草MTD為90 g/kg。

2.3? 附子、甘草配伍比例確定

2.3.1? 附子、甘草給藥劑量確定

按急性毒性評價結果，附子給藥量最小值為LD₅₀，最大值為2×LD₅₀;甘草給藥量最小值為臨床用藥的低劑量，最大值為MTD。最終確定附子給藥劑量為30～60 g/kg，甘草給藥劑量為1～90 g/kg。

2.3.2? 因素與水平的確定

根據均勻設計U7*（7⁴）表，將附子、甘草給藥劑量分別作為考察因素1、因素2，每個因素分別取7個水平，附子與甘草劑量見表2，劑量配比見表3。

2.4? 不同配伍比例附子、甘草毒性評價

2.4.1? 不同配伍比例附子、甘草水煎液毒性測定

ICR小鼠70只，雌雄各半，適應性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為7組，每組10只。各組小鼠灌胃給藥2次，按試驗方案將配制藥液全部灌完。給藥后立刻開始觀察小鼠神經系統、循環系統、消化系統的毒性反應，中毒癥狀發生的時間、持續時間、恢復情況，對死亡小鼠及時進行大體解剖觀察，記錄所觀察到的變化，統計各組小鼠死亡數并比較各組死亡率。7 d后將全部小鼠處死并解剖觀察，記錄所觀察到的變化。

2.4.2? 附子、甘草不同配伍比例毒性試驗結果

小鼠死亡多發生在給藥后0～12 h內，解剖發現肝臟邊緣發黃或發黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發黑。給藥24 h后，無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復正常狀態。附子、甘草不同配伍比例毒性試驗結果見表4，附子、甘草不同配伍比例各組小鼠死亡曲線。結果顯示，附子配伍甘草后對小鼠的毒性降低。

2.5? 附子、甘草不同配伍比例小鼠死亡率分析

采用SPSS17.0統計軟件對均勻試驗結果進行多元線性回歸分析，建立多元函數及F檢驗。得多元函數模型Y=70.576-1.635F-1.455G+0.032F²+0.012G²（Y表示死亡率，F表示附子，G表示甘草），應用相關系數R評價函數模型，R=0.985，R²=0.97，調整R²為0.91。該回歸方程經F檢驗，差異有統計學意義（P=0.059），見表5。針對函數模型求偏導數，求得最佳配比為附子∶甘草為0.42∶1。

2.6? 附子、甘草最佳配伍比例減毒效果評價

2.6.1? 預試驗

ICR小鼠16只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質量計算灌胃體積。各組按設定的劑量分別灌胃給藥，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量所在范圍。預試驗結果表明，附子、甘草最佳配比為0.42∶1，受給藥體積和給藥濃度限制，無法測出LD₅₀，但小鼠給藥后出現毒性反應，故改測MTD。

2.6.2? 正式試驗

ICR小鼠22只，雌雄各半，適應性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為2組，對照組7只，給藥組15只，按0.4 mL/10 g體質量計算灌胃體積。對照組灌胃給水2次，給藥組按附子、甘草最佳配比組灌胃給藥2次，給藥間隔時間均為6 h。給藥后立刻開始觀察小鼠神經系統、循環系統、消化系統的毒性反應，記錄中毒潛伏期、開始出現死亡的時間、死亡只數等，及時解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。14 d后，全部小鼠進行解剖，記錄觀察到的變化。

2.6.3? 附子、甘草最佳配比最大耐受量測定結果

小鼠給藥后出現身體顫抖、惡心干嘔、行動遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動、俯臥不動。小鼠死亡前全身顫抖、怠動無力、呼吸急促。動物死亡發生在第2次給藥4 h后，解剖發現肝臟邊緣發黃或發黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發黑。小鼠第2次給藥24 h后漸漸恢復正常。14 d后將所有小鼠處死，解剖，發現部分小鼠胸腔內有瘀血，肝臟、腎臟顏色均較淺。給藥組小鼠死亡3只，死亡率為20%。通過計算，得到小鼠日MTD為100 g/kg，MTD倍數相當于體質量60 kg成人臨床每日劑量的133.33倍。

3? 討論

附子作為回陽救逆第一要藥，在中醫臨床急危重癥的救治中具有非常重要的地位，尤其隨著近年“扶陽學派”興起，附子在臨床廣泛而大量使用，其劑量的選擇常超出藥典規定劑量，如何在保持附子藥效的同時減少其對機體的毒副作用成為亟待解決的問題。配伍甘草為附子減毒方法之一，關于配伍比例研究在文獻中常見的有附子、甘草為1∶1的比例，有部分文獻探討了配伍比例對附子毒性的影響，但僅局限于1∶2、1∶1、2∶1不同比例，而藥物比例對復方或藥對的藥效或毒性的影響作用十分重要。本研究中不同配伍比例的附子、甘草毒性評價結果表明，附子與甘草配伍后，小鼠死亡率降低，且隨著甘草配伍比例增加，小鼠死亡率呈現“降升交替”的現象，但整體趨勢是下降的。本實驗采用均勻設計法對附子、甘草配伍比例對附子毒性進行了優化研究，結果0.42∶1附子與甘草配比為最佳比例;附子與甘草按照0.42∶1配伍使用后，附子毒性大大降低，MTD是附子LD₅₀3倍多，且小鼠死亡率低，說明該配比減毒效果好。

本研究發現，附子配伍甘草后小鼠的死亡時間推后，附子單用時，小鼠死亡多集中在給藥后4 h內，而配伍甘草后小鼠死亡時間多集中在給藥后4～12 h內，說明甘草可緩附子之性急和性毒，符合章津銘^[19]從“藥理-化學-藥代”相結合層面，初步揭示附子配伍甘草“毒減而效不減”作用機制——基于兩者煎煮過程，甘草成分與附子毒（效）成分形成復合物而逐漸沉積于湯液底部，在湯液溫服條件下游離態和結合態的毒（效）成分均進入機體，結合態成分在胃腸道中緩慢釋放，從而實現毒（效）組分的不同步吸收，“緩吸收之急而解其毒，延吸收之時而增其效”。中毒死亡小鼠解剖結果顯示，附子對肝臟、心臟、脾臟具有毒性，尤其肝臟。肝臟是體內重要的代謝器官，含有大部分代謝酶，其中CYP3A4為烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的主要代謝酶。有研究表明，附子水煎液對大鼠CYP3A4有誘導作用，從而使CYP3A4被酶解，影響肝臟代謝^[20]，這也可以解釋中毒死亡的小鼠為何肝臟邊緣發黃發黑。

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