Box-Behnken響應面法優(yōu)化健脾祛濕丸醇提工藝

依孜提·帕力哈提 張剛 王萍

摘要：目的 ?采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝。方法 ?以鹽酸小檗堿、苦參堿含量及浸膏得率的綜合評分為指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面法考察乙醇濃度、加醇倍量和提取時間對健脾祛濕丸醇提工藝的影響。結果 ?最佳提取工藝為：加10倍量60%乙醇，回流提取3次，每次2 h。結論 ?本試驗優(yōu)選的醇提工藝穩(wěn)定、可行，為工業(yè)大生產(chǎn)奠定了基礎。

關鍵詞：健脾祛濕丸;醇提工藝;鹽酸小檗堿;苦參堿;Box-Behnken響應面法

中圖分類號：R283.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0084-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.018

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Abstract： Objective To optimize the ethanol extraction process of Jianpi Qushi concentrated pills by using Box-Behnken response surface method. Methods On the basis of single factor test， taking the comprehensive scores of content of berberine hydrochloride and matrine and extract yield as indicators， the effects of ethanol concentration， alcohol addition and extraction time on alcohol extraction process were examined by Box-Behnken response surface method. Results The optimal extraction process was adding 10 times amount of 60% ethanol， reflux extracting 3 times and 2 hours each time. Conclusion The optimized ethanol extraction process is stable and predictable， which can lay foundation for industrial production of Jianpi Qushi concentrated pills.

Keywords： Jianpi Qushi concentrated pills; ethanol extraction process; berberine hydrochloride; matrine; Box-Behnken response surface method

健脾祛濕丸處方來源于新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科劉紅霞教授多年臨床實踐的經(jīng)驗方，由黃柏、苦參、白術、土茯苓等藥組成，具有健脾祛濕、潤燥止癢功效，臨床用于脾虛濕盛所致的白疕（尋常型銀屑病）靜止期及慢性濕疹，證見皮疹斑塊色淡、肥厚浸潤，難以消退，反復發(fā)作，伴有面色不華，舌質(zhì)淡胖。黃柏苦寒，瀉火解毒、清熱燥濕，其主要活性成分為鹽酸小檗堿，含量達1.4%～5.8%，藥理作用為抗炎、抗菌、免疫抑制、抗?jié)兊龋淇寡鬃饔弥饕ㄟ^下調(diào)炎癥介質(zhì)的mRNA表達來實現(xiàn)^[1-5]。苦參具有清熱解毒、利濕止癢功效。苦參堿為苦參的主要活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗纖維化和免疫抑制等多方面藥理活性，可用于瘙癢性、炎癥性、免疫性等皮膚疾病的治療^[6-10]。健脾祛濕丸原以散劑形式作為醫(yī)院制劑在臨床應用多年，使用不便，患者依從性較差，濃縮丸劑在保持散劑療效的同時能克服以上缺點，并可提高藥物穩(wěn)定性，減少刺激性，遮蓋不良口感，方便患者服用。本試驗依據(jù)處方功能、主治及組方藥物的理化性質(zhì)，運用Box-Behnken響應面法優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝，為該制劑工業(yè)大生產(chǎn)奠定基礎。

1? 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 2424、Waters 2996），美國Waters;SI-234電子天平（d=0.1 mg），丹佛儀器（北京）有限公司;AGL-135型電子天平（d=0.01 mg），瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;Direct-Q 5型超純水儀，美國Millipore公司;Dl-820智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司;DLSB-10/20低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KDM型調(diào)溫電熱套，山東甄城光明儀器有限公司。

鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212，純度86.7%）、苦參堿對照品（批號110805-200508，純度99.8%），中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純（Fisher公司），磷酸等其他試劑均為分析純，超純水。苦參、黃柏、白術等飲片均購于亳州市中正中藥材飲片有限公司，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）各藥項下規(guī)定。

2? 方法與結果

2.1? 鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1? 色譜條件

采用Symmetry Shield C18柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動相為乙腈∶0.1%磷酸溶液（每1000 mL磷酸溶液加十二烷基磺酸鈉1.0 g）=45∶55，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長265 nm^[11]。

2.1.2? 對照品溶液的制備

精密稱取適量鹽酸小柏堿對照品，加流動相制成濃度為1.02 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品貯備液。

2.1.3? 供試品溶液的制備

稱取處方中擬醇提的藥物飲片，加10倍量60%乙醇，每次1 h，加熱回流提取2次，合并提取液，取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加60%乙醇定容至刻度，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 陰性對照溶液的制備

按處方量稱取除黃柏以外擬醇提的藥物飲片，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5? 線性關系考察

精密吸取“2.1.2”項下對照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積積分值對質(zhì)量濃度進行回歸，得回歸方程Y=37 819 336.69X-163 479.38（r=0.999 5），結果表明鹽酸小檗堿在2.00～10.00 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.6? 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下對照品貯備液，按“2.1.1”項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算得鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.37%，表明儀器精密度良好。

2.1.7? 重復性試驗

稱取擬醇提藥物飲片，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果鹽酸小檗堿峰面積RSD=1.35%，表明重復性良好。

2.1.8? 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24、48 h測定，結果鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.99%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9? 加樣回收率試驗

取鹽酸小檗堿含有量已知的供試品6份，精密加入鹽酸小檗堿對照品適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結果平均回收率為100.11%，RSD=1.78%，表明加樣回收率良好。

2.2? 苦參堿含量測定

2.2.1? 色譜條件

采用Symmetry Shield C18柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動相為乙腈∶甲醇∶三乙胺∶磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）=12∶12∶0.1∶76，進樣量10 μL，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm^[12-13]。

2.2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取適量苦參堿對照品，加甲醇制成濃度為0.51 mg/mL的苦參堿對照品貯備液。

2.2.3? 供試品溶液的制備

稱取處方中擬醇提的藥物飲片，加10倍量60%乙醇，回流提取2次，每次1 h，取醇提液30 mL，精密加入三氯甲烷-甲醇-濃氨水（40∶10∶1）混合溶液50 mL并超聲處理30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取下層，蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4? 陰性對照溶液的制備

按處方量稱取除苦參外擬醇提的藥物飲片，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5? 線性關系考察

精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.07、0.14、0.21、0.28、0.35 mg/mL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積積分值對質(zhì)量濃度進行回歸，得回歸方程Y=6 950 797.44X-9791.88（r=0.999），結果表明苦參堿在0.70～3.50 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.6? 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液，按“2.2.1” 項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得苦參堿峰面積RSD=0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.7? 重復性試驗

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，計算得苦參堿峰面積RSD=0.72%，表明該方法重復性良好。

2.2.8? 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24、48 h測定，計算得苦參堿峰面積RSD=0.83%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9? 加樣回收率試驗

取苦參堿含有量已知的供試品溶液6份，精密加入苦參堿對照品適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，結果平均回收率為100.03%，RSD=1.85%，表明加樣回收率良好。

2.3? 浸膏得率測定

將50 mL醇提液精密吸取至已干燥恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱干燥3 h，置于干燥器冷卻30 min，迅速精密稱重，計算浸膏得率。浸膏得率（%）=浸膏質(zhì)量×供試品溶液體積÷（藥物飲片總質(zhì)量×移取供試品溶液體積）×100%。

2.4? 提取工藝優(yōu)選

以乙醇濃度、加醇倍量和提取時間為自變量，以鹽酸小檗堿、苦參堿和浸膏得率的綜合評分為因變量，根據(jù)評價指標對醇提工藝的影響擬定權重，以各指標綜合評分作為提取效果的評判依據(jù)。健脾祛濕丸方中黃柏為臣藥、苦參為佐藥，故給予鹽酸小檗堿40%權重，苦參堿和浸膏得率各給予30%權重，分別計算各指標評分及綜合評分。指標評分（%）=測得值÷最大值×權重×100%。綜合評分=鹽酸小檗堿評分+苦參堿評分+浸膏得率評分。

2.5? 單因素試驗

2.5.1? 提取次數(shù)

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將乙醇濃度固定為60%，加醇倍量固定為10倍，提取時間固定為1 h，依次考察提取1、2、3次，結果綜合評分呈遞增趨勢，故最佳提取次數(shù)為3次。

2.5.2? 乙醇濃度

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，加醇倍量固定為10倍，提取時間固定為1 h，結果乙醇濃度為60%時，綜合評分最高，故將50%、60%、70%乙醇濃度作為響應面設計范圍。

2.5.3? 加醇倍量考察

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，乙醇濃度固定為60%，提取時間固定為1 h，結果加醇倍量為10倍量時，綜合評分最高，故將8、10、12加醇倍量作為響應面設計范圍。

2.5.4? 提取時間

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，乙醇濃度固定為60%，加醇倍量固定為10倍，當提取時間為2 h時，綜合評分最高，故選提取時間1.5、2.0、2.5 h為響應面設計范圍。

2.6? Box-Behnken響應面法優(yōu)化提取工藝

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，在單因素試驗基礎上，確定各因素的適宜范圍，提取次數(shù)固定為3次。以乙醇濃度（A）、加醇倍量（B）和提取時間（C）作為考察指標進行Box-Behnken響應面設計^[14]，試驗因素與水平見表1。采用Design Expert 8.0.4軟件設計試驗方案，見表2。

2.6.2? 驗證試驗

通過數(shù)據(jù)分析得到的最佳提取工藝為：稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，加入59.44%乙醇10.27倍，提取2.13 h。結合實際生產(chǎn)，確定最佳工藝為：加入60%乙醇10倍，提取2 h。在最優(yōu)工藝下進行3次驗證試驗，結果鹽酸小檗堿、苦參堿平均質(zhì)量分別為25.48、38.59 mg，浸膏得率為29.10%，綜合評分為93.08%，與預測值（94.44%）接近，且鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為84.61%，苦參堿轉(zhuǎn)移率為76.02%，表明該模型預測性較好，可用于優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝。

3? 討論

本研究通過單因素試驗考察多個因素水平，篩選出最佳提取方案，使進入響應面設計試驗的范圍縮小;以綜合評分為評價指標，鹽酸小檗堿、苦參堿及浸膏得率為影響因素進行試驗設計與模型擬合，并對最優(yōu)提取工藝進行驗證，結果表明該方法合理可行。苦參堿含量測定首先參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）苦參項下方法，結果有效成分無法分離。通過查閱大量文獻總結發(fā)現(xiàn)，甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液流動相較適合，故考察了9∶10∶72～15∶15∶80共12個比例，其中12∶12∶76條件下色譜峰分離度較好，且加入三乙胺溶液可減少拖尾，進而考察了pH值對分離情況及峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當pH=6.8時結果最佳。制備供試品溶液時，為有效提取苦參總堿生物堿類成分，應首先使生物堿游離，故采用先加濃氨水后加有機溶劑的方法;其次對提取溶劑進行考察，分別篩選了飽和正丁醇、乙醚和三氯甲烷3種試劑，結果表明用三氯甲烷超聲處理的提取效率最高，故采用三氯甲烷作為提取溶劑。

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