基于噬菌體進行細(xì)菌檢測的研究進展

胡 宇，茍惠天

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

細(xì)菌感染已造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟損失。由細(xì)菌引起的人膿毒血癥是高收入國家的第十大死因[1]。此外，醫(yī)院是病原菌發(fā)生的自然場所，歐洲每年有410萬患者受到與醫(yī)療衛(wèi)生有關(guān)的感染。在美國，醫(yī)院感染每年導(dǎo)致10萬人死亡。食品工業(yè)也極易受到細(xì)菌污染。2015年，180萬人死于食用受感染的食物或水。所有這些都需要迅速和可靠地檢測和鑒定細(xì)菌。傳統(tǒng)的檢測方法是先分離培養(yǎng)目標(biāo)菌，然后進行生化鑒定。該方法雖然便宜，但大多需要72 h才能得到檢測結(jié)果。這在醫(yī)療、食品加工等行業(yè)由于檢測耗時，顯示出很大弊端。隨即，出現(xiàn)一些新的檢測方法，如PCR方法、DNA芯片、酶聯(lián)免疫吸附試驗和質(zhì)譜分析等[2-4]。但以上方法都需要專業(yè)的設(shè)備，操作者具有一定的專業(yè)技能，而且費用昂貴。另外，核酸為基礎(chǔ)的各種分析方法在細(xì)菌死亡的情況下容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。同時，PCR方法敏感性很高，不同的菌株或突變體可能無法得到正確的鑒定。基于免疫學(xué)的各類檢測方法，在很大程度上又受到抗體的限制。綜上，近年來將生物傳感器應(yīng)用于細(xì)菌檢測，被認(rèn)為是一種很有發(fā)展前景的方法[5,6]。

噬菌體是特異性感染細(xì)菌的一類病毒，它們對宿主細(xì)菌的天然親和力可用于設(shè)計高度特異性的工具。由于自然界存在大量形狀和性質(zhì)不同的噬菌體，因此可以設(shè)計檢測幾乎所有細(xì)菌菌株的生物傳感器。鑒于噬菌體對細(xì)菌具有高特異性，因此可以篩選到一些選擇性檢測目標(biāo)細(xì)菌的噬菌體。另外，與抗體不同，噬菌體的批量生產(chǎn)簡單且廉價，通過感染細(xì)菌溶液即可獲得大量的子代噬菌體。這些優(yōu)勢使噬菌體成為生物傳感器和其他分析中進行細(xì)菌識別的首選物質(zhì)[7]。

在細(xì)菌檢測中，基于噬菌體的生物傳感器有幾種可能的設(shè)計。最直接的是利用野生型噬菌體，因為它們在自然界中無處不在。也可對噬菌體進行基因工程改造，改造修飾后可更好地應(yīng)用在一些特殊的細(xì)菌檢測中[8]。最初，利用噬菌體分型方法可對細(xì)菌種類進行鑒定。該方法主要通過觀察是否形成特性噬菌斑來判定。隨后，噬菌體還用于細(xì)菌的檢測。例如，噬菌體可以作為簡單的識別元件，將靶細(xì)菌和檢測中的其他化合物（標(biāo)記物等）進行連接。噬菌體沉積在固體基質(zhì)上形成傳感層，結(jié)合適當(dāng)?shù)膫鞲衅骱螅愠蔀閭鹘y(tǒng)意義上的生物傳感器。另外，細(xì)菌檢測中還可通過判定噬菌體的擴增和細(xì)菌裂解物的釋放來實施。針對細(xì)菌檢測中的噬菌體不同研究，綜述如下。

1 噬菌體作為檢測信號

噬菌體感染過程導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)噬菌體擴增，并在細(xì)菌裂解后釋放噬菌體。在此過程中釋放的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含有多種化合物，對它們的選擇性檢測可作為細(xì)菌存在的標(biāo)志。例如，Chen等在T7噬菌體介導(dǎo)的靶細(xì)菌裂解后檢測到β-半乳糖苷酶的釋放[9]。β-半乳糖苷酶能使氯酚紅β-d-半乳糖苷由黃色變?yōu)榧t色，從而使比色分析成為可能。利用該方法可檢測到濃度為104CFU/ml 的大腸桿菌。隨后，Chen等利用釋放的β-半乳糖苷酶催化生成對氨基酚(PAP)，PAP還原離子銀，在金納米顆粒上形成銀層，導(dǎo)致表面等離子體共振峰的藍(lán)移，但該方法并沒有提高檢測限。另一種方法，是將檢測β-半乳糖苷酶，基因修飾噬菌體以及電化學(xué)三者結(jié)合起來[10]。基因修飾后的T7噬菌體在大腸桿菌內(nèi)引起β-半乳糖苷酶的過量表達(dá)，催化PAP生成，然后用伏安法檢測PAP。除了β-半乳糖苷酶，熒光素酶，蛋白酶或堿性磷酸酶也被證明可用于這種檢測。這些方法的操作原理基本相同，都是基于酶催化與發(fā)光產(chǎn)物的反應(yīng)。

噬菌體感染細(xì)菌的內(nèi)在作用是將許多子代噬菌體釋放到環(huán)境中。在細(xì)菌感染的溶液中加入少量特異噬菌體，會導(dǎo)致樣品中噬菌體濃度迅速增加。噬菌體數(shù)量的增加被證明是細(xì)菌檢測的另一個理想信號。Anany等研究表明，大腸桿菌感染中產(chǎn)生的子代噬菌體可以用實時定量PCR來檢測[11]。該方法對布魯氏桿菌的檢測也有一定的參考價值[12]。Rees等展示了一種基于串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的技術(shù)，用于檢測胰蛋白酶消化K噬菌體后，形成的蛋白質(zhì)和多肽。該方法也適用于金黃色葡萄球菌對抗生素敏感性的測定。如果在含有抗生素的樣本中檢測到噬菌體擴增，則認(rèn)為該樣本對這些抗生素具有耐藥性[13]。另外，通過橫向免疫層析（LFI）也可檢測噬菌體。Cox等報道，橫向流動導(dǎo)致染色的納米粒子與從炭疽芽孢桿菌中釋放的子代噬菌體結(jié)合，然后，將這種標(biāo)記的噬菌體濃縮在膜上，即形成可肉眼觀察的有色線[14]。

利用噬菌體在不裂解宿主細(xì)菌的情況下，也可以檢測細(xì)菌。其原理是利用基因工程方法制備報告噬菌體，感染細(xì)菌，進入溶原循環(huán)后在完整細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生檢測信號。Vinay等使用具有編碼綠色熒光蛋白（GFP）的溫和噬菌體HK620和P22分別感染大腸桿菌和沙門氏菌。GFP在感染的細(xì)菌內(nèi)表達(dá)并被檢測[15]。此外，編碼熒光素酶的噬菌體也可用于細(xì)菌檢測。Sharp等用編碼熒光素酶的溫和噬菌體φV10感染大腸桿菌，在加入熒光素后產(chǎn)生強烈的發(fā)光信號，此方法能夠在2 h內(nèi)檢測到105CFU/ml的大腸桿菌。Wu等改造PP01噬菌體，使其攜帶與外殼蛋白融合的四半胱氨酸標(biāo)簽。該噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生子代噬菌體后，用膜滲透染料標(biāo)記四半胱氨酸標(biāo)簽來染色細(xì)菌，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡即可檢測單個細(xì)菌[16]。

2 利用噬菌體形成傳感層

使用噬菌體檢測細(xì)菌的方法，是將噬菌體顆粒固定在固體基質(zhì)上作為特異性生物受體。Bennett等1997年首次報道了通過固定的噬菌體捕獲宿主細(xì)菌進行特異性檢測的技術(shù)。對于噬菌體傳感層，選擇適當(dāng)?shù)膫鞲衅饕詫崿F(xiàn)信號讀出，顯得尤為重要[17]。Srivastava等在納米硅平臺上用4-氨基苯硫酚和戊二醛修飾銀薄膜，然后在其表面固定T4噬菌體，利用表面等離子體共振技術(shù)（SERS）提高細(xì)菌檢測的敏感性，檢測限為102CFU /ml[18]。Horikawa等利用包被噬菌體的磁彈性生物傳感器來檢測鼠傷寒沙門氏菌，通過共振頻率的實時變化，能夠精確測量超低濃度的細(xì)菌[19]。

近年來，利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）進行細(xì)菌檢測的報道越來越多。Bhardwaj等利用固定的噬菌體對石墨烯電極上的金黃色葡萄球菌進行選擇性檢測[20]。另外，利用EIS獲得的生物傳感器性能穩(wěn)定，檢測范圍廣，靈敏度高。該技術(shù)還可用于分析原始樣品（屠宰污水，血液等）。Moghtader等將碳電極和EIS技術(shù)結(jié)合，用金納米顆粒包被石墨電極，隨后再用T4噬菌體包被，這樣不僅增加金納米顆粒的表面電導(dǎo)率，而且還能有效固定噬菌體[21]。除了電化學(xué)阻抗譜，也有學(xué)者提出了其他電化學(xué)方法。在檢測細(xì)菌銅綠假單胞菌時，電化學(xué)發(fā)光被用于檢測與PaP1噬菌體綴合的羧基石墨烯層的信號[22]。

隨后，大量研究都集中在改進噬菌體傳感層的性能。最直接的方法是通過增加定向噬菌體的數(shù)量來增強信號。Wang等提出一種噬菌體在聚羥基鏈烷酸酯表面沉積的新方法，同時提出該表面的噬菌體數(shù)量不應(yīng)超過一定限度，覆蓋率過高會導(dǎo)致噬菌體間的空間位阻[23]。Olsson等人對最佳噬菌體覆蓋率進行了分析，提出超過95%的噬菌體在傳感層中具有共同的定向結(jié)構(gòu)，包括頭部和具有纖維組織的尾部。受體結(jié)合蛋白就位于纖維末端和尾部，噬菌體只能用一端檢測并結(jié)合細(xì)菌。因此，噬菌體定位對于有效檢測細(xì)菌至關(guān)重要。有研究報道，將噬菌體的頭部進行重組修飾，使其能與傳感器表面上抗生物素蛋白相結(jié)合。也有利用非基因工程方法，進行噬菌體定向的報道。噬菌體具有帶負(fù)電的頭部和帶正電的纖維尾部，因此可以通過靜電作用或在電場中進行定向。與物理吸附的噬菌體相比，表面化學(xué)修飾與交替電場相結(jié)合的方法，導(dǎo)致傳感層的靈敏度增加60倍，檢出限提高到100 CFU/ml[24]。

3 利用噬菌體捕獲靶細(xì)菌

噬菌體在細(xì)菌檢測中可作為生物復(fù)合物的一部分。通常，噬菌體與特定的納米顆粒結(jié)合，用于制備靶向細(xì)菌的生物復(fù)合物，即可從復(fù)雜樣品中分離或檢測細(xì)菌。磁分離技術(shù)不需要額外的離心或過濾。此外，還能夠?qū)⒛繕?biāo)細(xì)菌與復(fù)雜樣本中的其他成分有效分離，從而最大限度地減少信號收集過程中的基質(zhì)干擾。Liebana等首次提出，P22噬菌體固定在甲苯磺酰化的磁性顆粒上，可以特異性捕獲和預(yù)濃縮沙門氏菌，之后再通過電化學(xué)磁傳感器檢測細(xì)菌，可使檢出限降至3 CFU/ml[25]。但檢測程序復(fù)雜，設(shè)備試劑昂貴等缺點在很大程度上限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此，有學(xué)者提出將噬菌體分離與RT-PCR結(jié)合。利用磁分離技術(shù)，從樣品中分離大腸桿菌O157: H7后，噬菌體感染導(dǎo)致大腸桿菌裂解并釋放內(nèi)容物，通過RT-PCR定量檢測釋放的DNA，所有測定在2 h內(nèi)完成，LOD為102CFU/mL[26]。

也有研究將磁分離與酶比色檢測相結(jié)合。Laube等將該方法用于沙門氏菌的快速檢測。首先，沙門氏菌被經(jīng)過修飾的噬菌體-磁性納米顆粒復(fù)合物捕獲，依次加入與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的特異性抗沙門氏菌抗體及底物(四甲基聯(lián)苯胺，TMB)后，在450 nm處測定吸光度。該方法在2.5 h內(nèi)便獲得了牛奶樣品中19 CFU/ml的檢測限[27]。更有研究，將大腸桿菌的T4噬菌體與雙功能磁熒光微粒子共價結(jié)合。磁性促進捕獲細(xì)菌的分離，熒光使細(xì)菌-生物結(jié)合物的簡單分析成為可能，利用流式細(xì)胞術(shù)使整套細(xì)菌檢測在15 min內(nèi)即可完成。由于檢出限較低，該方法適用于快速、特異的篩選試驗[28]。細(xì)菌磁性分離技術(shù)能夠?qū)⒛繕?biāo)細(xì)菌與樣品的其他組分離，無需任何預(yù)富集。因此，可以大大縮短整個細(xì)菌檢測分析的時間。

4 結(jié)語

利用噬菌體檢測細(xì)菌的相關(guān)研究已有諸多報道。但由于種種原因，基于噬菌體的診斷方法仍然只有少數(shù)被商業(yè)化應(yīng)用。近年來，生物傳感器、納米技術(shù)等新型技術(shù)的介入，有效提高了檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。但進一步的發(fā)展仍需要生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等多學(xué)科密切合作，才能提出快速、敏感、低廉的檢測方法。