角膜新生血管轉基因老鼠模型的應用進展

方健文，袁 晴，邵 毅

0引言

角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是一種在炎癥、缺氧、創傷或角膜緣干細胞缺損情況下發生的病理狀態[1]。正常的角膜是無血管的，在某些情況下，毛細血管或淋巴管侵入角膜后會產生CNV[2]。角膜的透明程度對于視力十分重要。CNV的產生使得過多的血管從結膜向角膜生長，可能導致視力障礙，甚至失明，是一種常見的疾病后遺癥[3]。CNV可以通過新型抗血管生成療法治療，盡管目前治療效果仍不理想[4]，但是通過在動物模型中進行參數對比和機制研究，同時進行組織學比較及藥物治療等研究將會為CNV的治療帶來新的方向。

1 CNV的形成機制

CNV的形成機制涉及炎性介質、細胞、細胞因子和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)之間的相互作用，是一個相互調節的復雜過程[5]。正常情況下，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白在角膜上皮細胞、內皮細胞和角膜緣血管內皮細胞中基礎性表達，被內源性表達的可溶性VEGF受體隔離，以維持角膜無血管的狀態及其良好的透明度[5]。在眼前段炎癥、創傷和缺血等病理情況下，或是在角膜水腫、角膜瘢痕、脂質沉積、角膜移植等其他情況下，VEGF誘導CNV發生[6]。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)通過誘導CNV的內皮細胞產生尿激酶型纖溶酶原激活劑，使纖溶酶原轉化為纖溶酶，纖溶酶激活膠原酶，溶解血管的基底膜，誘導內皮細胞移行，從而促進CNV生長[7]。CNV的形成還可能與缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)相關[8]。缺氧狀態下，缺氧誘導因子-1α活性增強調控VEGF基因表達[9]。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)由血管內皮細胞分泌，能夠使細胞外基質和基底膜水解[10]。基質金屬蛋白酶與CNV的發生密切相關，通過抑制MMP-2和MMP-9的表達，新生血管的生長受到明顯抑制[11]。

2 CNV動物模型制備方法

目前建立的CNV模型有家兔模型和老鼠模型，家兔在研究人類角膜疾病方面具有多方面的優勢[12]：(1)家兔眼球相對較大，方便手術操作和觀察；(2)實驗中可以同時對同一家兔的左右眼進行對照實驗，避免個體差異；(3)家兔眼角膜與人類角膜解剖結構相似等。

建立CNV模型的方法有：縫線法、熱燒灼法、化學燒傷法，以及角膜囊袋法，如VEGF緩釋藥丸誘導法、bFGF緩釋藥丸誘導法和內毒素緩釋聚合物誘導法等。縫線法損傷角膜上皮和基底細胞，一方面會引起角膜微環境缺氧，觸發VEGF的表達，另一方面炎癥細胞浸潤產生大量促新生血管生長因子，使VEGF高表達[13]。熱燒灼法主要是通過熱損傷角膜引起局部的前列腺素合成增加，持續產生促血管生成因子，使白細胞浸潤和新生血管增生[14]。這些基于損傷制作的CNV模型被廣泛地應用，具有操作簡單、成本低等優點。其缺點是容易造成其他非血管因素影響，如角膜穿孔、上皮增生等。

角膜囊袋法是通過將包含促血管生成因子的藥丸聚合物植入角膜，藥物的緩慢釋放誘導血管生成[15]。金玲等[16]分別將7.5%、15%和30% 3種濃度內毒素緩釋聚合物植入兔角膜基質層，觀察到7.5%內毒素藥膜誘導產生的新生血管生長稀疏、速度緩慢、范圍較小，達不到建立模型的要求；植入30%內毒素藥膜，角膜局部水腫反應嚴重，新生血管粗亂且密集生長，不利于觀察及定量分析；15%內毒素藥膜誘導產生的CNV生長規律、密度均勻、血管清晰、角膜水腫輕，便于連續、動態地觀察和分析。結果表明內毒素能夠誘導CNV的生成并呈現出劑量依賴型，可以通過調節內毒素濃度制作不同的模型，來滿足各種實驗研究需要。

此外，還可以通過角膜移植[17]、角膜基質內注射牛白蛋白[18]等方法制作免疫原性CNV模型。該種模型高度模擬了臨床環境中的CNV病程，是研究角膜移植術后排斥反應的理想模型。

3轉基因老鼠模型在研究CNV中的應用

CNV的轉基因老鼠模型可以不需要任何其他的實驗操作干涉，可以用來研究不同的相互關聯的促血管生成信號級聯反應。近年來，基因工程老鼠的研究進展激發了對自發性CNV的研究。

Niederkorn等[19]發現，無胸腺裸鼠(nu/nu)的角膜上皮下會長出新生血管，而重度聯合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，SCID)小鼠的角膜是無血管的，說明角膜血管的存在與裸鼠的免疫缺陷狀態無關，然而在無毛的突變老鼠株(SKH1；hr/hr)中發現了與裸鼠相似的角膜血管化。裸鼠這種自發性CNV可能是由于血管生成因子與抗血管生成因子之間的局部失衡所致[20]。

3.1與VEGF信號通路相關的CNV轉基因鼠Corn1小鼠缺失細胞骨架蛋白destrin的編碼基因，表現出早發性、自發性CNV和新生淋巴管，新生血管和淋巴管可以通過阻斷VEGF-VEGFR-3信號減少：通過外部應用抗VEGFR-3抗體或sVEGFR-1[21]。CNV在出生后4wk達到100%患病率，12mo內未見消退，而角膜新生淋巴管患病率不完全(3mo達到60%，12mo下降至約15%)。值得注意的是，該模型顯示低炎癥形式的血管生成。以角膜切片CD45陽性細胞數量來衡量炎癥活性，Corn1角膜炎癥活性明顯低于同種異體角膜移植后角膜炎癥活性。雖然應用抗VEGFR-3抗體后CNV部分消退，但仍存在一定程度的病理新生血管。Corn1表型發病早，外顯率高，非常適合用于新生血管的研究，可用于評估已知或未知的抗血管生成藥物。

角膜表達的可溶性VEGF受體-1[22](soluble VEGF receptor-1，sVEGFR-1)和可溶性VEGF受體-2[23](soluble VEGF receptor-2，sVEGFR-2)分別能抑制血管生成和淋巴管生成。在對它們的研究中發現，pCre/VEGFR1loxP/loxP和LeCre/VEGFR-2loxP/loxP小鼠模型缺少這些可溶性受體的表達，從而會自發地出現新生血管和淋巴管。

連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)是一種與調節白細胞和內皮細胞遷移、血管發生與血小板聚集相關的緊密連接蛋白[24]。JAM-A缺陷小鼠表現出自發性CNV、炎癥和混濁[25]。這些變化與多種促炎和促血管生成系統的激活有關，其中包括TGF-b通路和VEGF-A-VEGFR-2通路。盡管JAM-A-/-小鼠模型的表型在實際應用中是不完全外顯性的，在對新生血管的研究中該模型還是非常具有潛力。

3.2與非VEGF信號通路相關的CNV轉基因鼠BTB-Kelch(bric-a-brac，tramtrack and broad complex，BTB-Kelch)蛋白KLEIP(kelch-like ECT2 interacting protein，KLEIP)是調節細胞遷移和細胞間連接形成的重要分子[26]。為了研究KLEIP對小鼠眼睛的作用，Hahn等[27]制作了KLEIP-/-小鼠模型，出生時KLEIP-/-小鼠與KLEIP+/+小鼠的角膜無明顯區別，眼瞼開放后KLEIP-/-小鼠開始出現上皮增生、進行性角膜營養不良，最終導致角膜混濁，伴有自發性基質血管化。Kather等[28]阻斷KLEIP-/-小鼠的VEGF信號并不能減少小鼠角膜血管和淋巴管的生長，說明該模型可以用來評估非VEGF靶向藥對新生血管的治療效果。KLEIP-/-小鼠的CNV與營養不良的角膜中存在巨噬細胞有關，但目前尚不清楚該模型中血管生成和(或)淋巴管生成是否需要這些巨噬細胞。在實踐中，由于KLEIP-/-CNV具有高外顯率，且表型進展的時間進程具有良好的特征，因此非常適合用于血管生成研究。

3.3與轉錄因子相關的CNV轉基因鼠cAMP應答原件結合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CBP/p300)的轉錄調節因子CBP/p300反式作用因子(CBP/p300-interacting transactivators with glutamic acid (E) and aspartic acid (D)-rich tail 2，Cited2)在成年老鼠角膜中較高表達，提示Cited2可能與角膜成熟和維持有關[29]。為了研究Cited2在角膜中的作用，Chen等[30]通過將Cited2-floxed小鼠與Le-Cre轉基因小鼠雜交，建立了表面外胚層衍生的眼部結構(包括角膜)中Cited2缺失的小鼠模型，表現為角膜混濁和自發性CNV。該模型有助于研究角膜中涉及的分子機制，還可以用來評估角膜疾病的治療方案。

人類配對盒基因Pax6(paired-box gene 6，Pax6)是脊椎動物和無脊椎動物眼睛發育的關鍵轉錄因子[31]。Davis等[32]通過將醛脫氫酶3a1(aldehyde dehydrogenase 3a1，Aldh3a1)啟動子融合到Pax6基因的編碼區制作了Pax6過表達轉基因小鼠模型，表現出角膜上皮異常和炎癥性基質新生血管。Pax6+/-雜合子小鼠則表現出相似的角膜血管化特征[33]。但是在對血管生成的實際研究中，Pax6+/-小鼠并不完全適合：表型出現早在出生后2wk，但是外顯率是不完整的。在Pax6過表達小鼠中，新生血管表型的患病率因遺傳背景的不同而不同，通常低于70%。為了建立標準的CNV模型，可以對這種小鼠經行育種優化。

叉頭框轉錄因子FoxC1(forkhead box transcription factor C1，FoxC1)是一種參與調控角膜血管生長的重要因子，Seo等[34]建立的FoxC1-/-小鼠模型和神經嵴(neural crest，NC)特異性敲除NC-FoxC1-/-小鼠模型表現出自發性角膜血管和淋巴管過度生長；雜合子FoxC1+/-小鼠模型和NC-FoxC1+/-小鼠模型則表現出相對溫和的表型如角膜緣血管受損，而且在角膜損傷情況下，血管和淋巴管相較于對照組明顯增多。該類模型的機制與MMP和sVEGFR-1密切相關[35]。對血管生成的研究中，這個模型非常具有吸引力，因為它以兩種方式簡化了實驗過程。首先，在這些小鼠中，CNV在出生時就存在；其次，雜合子小鼠也可以用于研究，這使得每窩產仔的生物樣本量增加了兩倍。

T細胞特異性表達組成性活性信號轉導因子和轉錄活化因子6(signal transducer and activator of transcription factor 6，Stat6)的轉基因小鼠是研究急性和慢性特應性皮炎的模型[36]。Conwell等[37]報道該模型表現出CNV。

3.4與自發性角膜腫瘤相關的轉基因鼠RAS-絲裂原活化激酶(RAS-mitogen activated kinase，RAS-MAPK)信號傳導是影響細胞增殖、遷移和細胞周期等細胞過程的多種生長因子和細胞外信號傳遞的主要途徑[38]。這一途徑的關鍵效應激酶是細胞外信號調節激酶1和細胞外信號調節激酶2(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)，它們被絲裂原激酶激酶1(mitogen kinase kinase 1，MEK1)激活[38]。Bargagna-Mohan等[39]報道了ERK1/2在轉基因小鼠Schwann細胞中活性升高，表現出CNV和自發性角膜神經纖維瘤，CNV的產生與入侵角膜中央的肥大細胞有關，這是對轉基因小鼠自發形成角膜腫瘤的首次報道。

3.5其他相關性CNV轉基因鼠富亮氨酸重復序列免疫球蛋白樣結構域(protein leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1)是角膜上皮角膜緣干細胞和眼上皮基底細胞的標志物，LRIG1的敲除會導致自發性角膜上皮異型增生及基質的CNV[40]。LRIG1是促炎癥的Stat3通路的負性調控因子，而在LRIG1-/-小鼠中抑制Stat3可以抑制該病理表型，防止角膜混濁。表達組成性活性Stat3的K5.Stat3C轉基因小鼠表現出相似的表型，包括角膜混濁和新生血管[40]。LRIG1-/-小鼠模型和K5.Stat3C轉基因小鼠模型可以用來研究自發性炎癥性CNV的機制。

4轉基因模型的優勢和局限性

在轉基因鼠模型中，角膜基質新生血管常與角膜上皮結構紊亂和角膜上皮向皮膚樣上皮轉化有關，例如，在LRIG1-/-、KLEIP-/-、Pax6+/-和Corn1小鼠中[21,28,40-41]。在小鼠模型中，導致角膜上皮結構改變的兩個病因是角膜緣干細胞(limbal stem cells，LSC)缺乏和上皮細胞增殖紊亂[42-43]。LSC缺失、角膜上皮發育不良和基質新生血管在LRIG1缺失的小鼠中被觀察到，LRIG1是一種中度特異性的LSC標記物和炎癥調節因子[40]。此外，角膜上皮細胞增殖能力與肌動蛋白細胞骨架的功能相關，例如Corn1中的角膜上皮營養不良是由于細胞內肌動蛋白細胞骨架重構受損所致[43]。KLEIP蛋白也與肌動蛋白細胞骨架組裝的調節有關，因此在KLEIP-/-小鼠CNV的發展過程中，角膜上皮肌動蛋白聚合可能是一個病因[26]。這些結果表明，不同轉基因小鼠CNV模型可能具有共同的發育機制。這也展示出自發CNV模型在血管生成研究中的作用，同時這些模型使得我們對CNV的機制有了更加深入的認識。

在角膜囊袋法中，一個或多個促血管生成遞質直接植入角膜，刺激血管和(或)淋巴管生長。然而，在基礎性血管生成的研究中，以血管生成的單遞質機制為中心的還原主義方法被更為全面的觀點所取代，涉及到血管生成的相互關聯調控機制。在轉基因CNV模型中，促血管生成信號部分來源于規范的VEGF信號(如Corn1模型)或VEGF獨立信號(如晚期KLEIP-/-CNV)。在幾個轉基因模型中，可以想象幾種不同的促血管生成機制的參與。因此，轉基因模型提供了在具有良好特征和實驗可接近的環境中研究這些相互交織機制的可能性。

在經典的角膜損傷模型中，CNV是由確切的刺激誘導產生的，遵循明確的發展模式。然而，一個潛在的問題是，損傷引發了過多的修復過程，其與CNV的具體關系尚不清楚。轉基因模型由于不依賴實驗干預，而是表現為繼發于自發病理過程的血管生成，因此開辟了一條不同的途徑。一些領域受益于轉基因模型的使用，例如炎癥機制的研究。CNV在外傷性模型中通常與顯著的炎癥活動有關。相應的，在損傷模型中，抗炎治療減少了CNV。相比之下，在CNV轉基因模型中，高炎癥和低炎癥模型都是可用的。此外，在其他轉基因模型中，如KLEIP-/-模型，炎癥存在，但其與血管生成的機制尚未研究。因此，CNV的轉基因模型為研究角膜炎癥與血管生成的新機制提供了一個框架。盡管如此，轉基因模型將補充而不是取代現有的CNV模型。

5展望

轉基因老鼠在對CNV的研究中可以補充其他新生血管模型，其表達的自發性CNV可以不用依賴實驗干預，與其他模型相比使得有可能在更接近真實的病理生理狀態下研究新生血管，加速了對角膜血管生成的研究。此外，轉基因老鼠模型還有助于研究角膜中的各種信號分子和通路，為研究角膜血管生成的機制提供了一個方便可行的方法，有助于進一步揭示CNV發生的機制。但是，由于缺少角膜損傷的修復過程等因素，轉基因老鼠模型并不能完全取代其他的CNV模型。CNV轉基因老鼠模型的出現，為抗新生血管治療方案的評估提供了有力的前景，將會是研究CNV機制和治療的良好平臺。