采用二代測序對脊髓性肌萎縮家系行胚胎植入前遺傳學診斷

倪夢霞，王瑋，鄭愛燕，丁潔，邢麗賢，劉敏娟，毛君，蒲艷，鄒琴燕，孟慶霞，李紅，偶健*，張癸榮*

(1.南京醫科大學附屬蘇州醫院 蘇州市立醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002；2. 北京市中科遺傳與生殖醫學研究院，北京 100026)

脊髓性肌萎縮癥(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一種以脊髓前角運動神經元退化變性為特征的常染色體隱性遺傳病，常見的臨床特征為對稱性、進行性的肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮和癱瘓[1-2]，其發病率約為1/6 000～1/10 000[3]，具有典型的臨床異質性。目前，國際上根據SMA的臨床表現，共將其分為4種亞型。Ⅰ型(Werdnig-Hoffman病)即嚴重型，出生6個月之內發病，患者不能坐立，通常2歲前死亡。Ⅱ型即中間型，出生6～18個月內發病，患者可以坐但無法站立亦無獨立行走能力，伴有關節攣縮和脊柱后突，壽命超過2歲，具體存活年齡通常視呼吸系統并發癥而定。Ⅲ型(Kugelburg-Welander 病)，出生18個月后發病，患者可獨立行走，但行走無力，伴有脊柱側突和骨質疏松，可存活至成年。Ⅳ型即成年型，發病年齡為15～60歲，35歲是高發年齡，患者可能出現行走困難，無消化系統和呼吸系統癥狀，存活時間與正常人無異[2，4]。除這幾種類型外，還有一種不常見的類型，稱為 SMA 0 型，這種類型發生在宮內，表現為明顯的胎動減少，若不及時采取措施，可于1歲內死亡。SMA患者主要的致病基因是運動神經元存活(SMN)基因，該基因編碼的蛋白是一種跨物種蛋白，生物信息學研究顯示該蛋白高度保守，且在身體各部位均有表達，其在脊髓運動神經元中表達量最高[5-8]。

本研究收集了1個SMA家系的臨床資料，采用Real-time PCR法檢測SMN1基因exon7 拷貝數，結合二代測序(NGS)及單體型連鎖分析為該家系提供遺傳咨詢，并為攜帶者夫婦進行胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)。

資料和方法

一、研究對象

2013年3月一對表型正常夫婦攜帶先證者于蘇州市立醫院生殖與遺傳中心進行遺傳咨詢。經體格檢查，發現先證者可以坐但無法站立亦無法正常行走，同時伴有關節攣縮及脊柱后突，被確診為SMA患者。經家系調查后，明確該夫婦生育過3次，其中1例為先證者，1例已死亡，另生育1健康女孩夭折。2014年至2016年另妊娠3次，于孕中期在本院行產前診斷均為SMA患兒，均引產(圖1)。2017年該夫婦要求行PGD再生育，簽署知情同意后在本院進行PGD。

圖1 家系圖

二、研究方法

1.SMN1基因檢測：收集先證者及其父母的EDTA-K2抗凝外周血樣本，采用TIANGEN試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。針對SMN1基因exon7設計特異性引物，引物 5′端分別用FAM和 HEX熒光基團標記，上游引物序列為：5′-CCTTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3′；下游引物序列為：5′-GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTT-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。隨后采用常州百代生物科技有限公司的Super MultiProbe Kit試劑盒進行Real-time PCR，分析實驗結果。

2.PGD策略：SMA PGD可使用單細胞全基因組擴增試劑盒(Sureplex，BlueGenome，英國)進行單細胞全基因組擴增(WGA)。利用該家系建立單體型，采取家系中收集的外周血樣本證實Sureplex WGA試劑盒可以有效擴增目標單核苷酸多態(SNP)位點和致病變異所在位置，證實全基因組擴增成功。這一家系將在通過單體型實驗驗證后進入PGD程序。可先對所有胚胎進行單體型連鎖分析和Sanger測序，不攜帶致病變異的胚胎再進行染色體拷貝數分析。

3.PGD流程：根據南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心制定的常規促排卵方案，取卵后進行卵胞漿內單精子注射(ICSI)人工授精。培養5～6 d后，將形成的4枚囊胚，按本中心常規操作流程行胚胎活檢，取5～8個滋養層細胞進行全基因組擴增[9]。

4.單體型連鎖分析：以SMN1基因(28 Kb)的exon7的70247773位點為目標區域，并在該基因的上游3M區域內選擇51個及下游2M區域選擇56個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER網站設計引物，經DNA純化、建庫和NGS后，選擇若干有效位點進行單體型分析。

5.全基因組低覆蓋度測序：取120 ng Sureplex全基因組擴增產物，對其進行酶切打斷，后經連接、純化、文庫擴增和低覆蓋度測序(0.03X)，利用生物信息學方法對24條染色體進行拷貝數分析。

結 果

一、SMN1基因檢測結果

先證者及其父母于蘇州市立醫院進行抽血檢測，Real-time PCR法檢測發現先證者父母的SMN1基因7號外顯子為單拷貝，而先證者(患兒1)為SMN1基因的7號外顯子純合缺失；胎兒1為行PGD后植入胚胎發育的胎兒，拷貝數正常；胎兒2～4為自然妊娠行產前診斷的羊水樣本，均為SMN1基因的7號外顯子純合缺失；胎兒5為生育的正常女孩，拷貝數正常(圖2)。

圖2 SMN1基因檢測結果

二、單體型連鎖分析結果

確定家系的致病原因后，以基因SMN1的exon7為目標區域，在該基因及基因的上下游選擇高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標記，NGS后選擇若干有效位點進行單體型分析。

三、NGS PGD結果

通過單體型連鎖分析之后進行單基因病PGD周期，形成4枚囊胚(胚胎1～4)，經檢測發現：未攜帶突變的整倍體囊胚1枚，單拷貝攜帶的整倍體囊胚1枚，單拷貝攜帶但為非整倍體囊胚1枚，致病的整倍體囊胚1枚(表1，表2)。將未致病的整倍體囊胚行FET后獲得臨床妊娠，產前診斷結果顯示未見異常，足月剖宮產分娩一正常男嬰，體重3 150 g，健康狀況良好。

表1胚胎單體型連鎖分析

表2 胚胎NGS PGD檢測結果

討 論

SMA于 1891 年由 Guido Werdnig 首次報告[9-10]，是一種以脊髓前角運動神經元退化變性為特征的常染色體隱性遺傳病。根據其臨床表現共分為4種亞型。目前，SMA的診斷方法主要包括血清肌酶譜檢測、SMA病理特點、神經電生理特征、分子生物學檢測[2]等。其中，SMA患者的血清肌酶譜檢測能夠與多數的肌源性疾病相區別，但這不能作為診斷SMA的唯一依據；而神經電生理檢查雖然不是SMA的特異性指標，卻作為一個重要的診斷指標，可以提高SMA患者基因診斷的陽性率；另外，肌肉活檢是一種有創性檢查，許多患者及家屬對這種方法較為排斥，且不同亞型的SMA患者具有不同的病理特點，這就使得臨床診斷困難[11-13]。因此，分子生物學檢測對于疑似SMA的患者，尤其是Ⅰ、Ⅱ型患者，可依據患者的典型臨床表現，將基因檢測作為首選的診斷方法。對于臨床表現不典型(尤其是Ⅳ型患者)，可將神經電生理和肌肉病理檢查作為診斷的可靠依據，再結合基因診斷做進一步確診。

SMA的致病基因即SMN基因，大小約38 000 bp，編碼294個氨基酸，由這些氨基酸組成的蛋白高度保守，全身各部位均有表達，在脊髓運動神經元中的表達量最高[14-15]。該基因定位于5號染色體，由于所在的染色體區域內結構復雜，且存在著重復序列和眾多假基因簇，導致其結構不穩定，極易發生基因的缺失、轉換[16-18]。SMN基因有2個高同源性拷貝，一個是位于端粒側的決定性基因SMN1基因；一個是位于著絲粒側的修飾性基因SMN2基因。2個高同源性拷貝僅有 5 個堿基的差異，其中2個堿基分別位于7和8號外顯子。SMA患者患病的主要原因是SMN1基因缺失，所占比例約為95%[19-20]。因此本中心采用Real-time PCR法檢測SMN1基因，當發現這對夫婦的SMN1基因exon7均為單拷貝，而先證者為SMN1基因exon7純合缺失時基本可以明確其患病原因，進而考慮采取PGD干預措施。

PGD技術是一種通過對體外受精形成的胚胎進行遺傳物質分析，以診斷胚胎是否存在遺傳異常，最終選擇無遺傳異常的胚胎植入宮腔，進而可以獲得正常胎兒的診斷方法。PGD技術作為一種輔助生殖手段，有著明顯的優勢，比如能夠有效地降低早期的流產率、新生兒缺陷的發生率以及胎兒的畸形率，可以使更多的家庭生育出健康的寶寶[21-22]。家族里已經生育過出生缺陷患兒的夫婦大多渴望優生優育，PGD技術可以從一定程度上滿足這些夫婦的需求。但是，PGD技術也面臨一些問題，比如操作繁瑣，價格昂貴，且需要對胚胎進行侵入性操作以獲得最終診斷。如何降低有創操作對胚胎造成的損傷還需要進一步探索，同時大樣本的長期隨訪觀察對子代的影響也是有必要的。

在本病例中先證者及其弟弟即為SMN1基因7號外顯子純和缺失突變致病，其父母均為雜合缺失。進行產前診斷選擇終止妊娠3例患病胎兒。該夫婦為避免再次妊娠患病胎兒的風險，選擇進行PGD，最終剖宮分娩一正常男嬰。先證者由于7號外顯子純合缺失，使其無法表達有功能的全長SMN蛋白，從而對機體造成影響。由此可見，對于攜帶者的基因檢測在遺傳咨詢及產前診斷中尤為重要。

目前，基于基因檢測的特異性和無創性以及SMN相關基因位點精確的靶向分子描述，分子生物學檢測逐漸成為確診SMA的金標準。迄今為止，SMA作為一種遺傳性神經肌肉疾病尚未有完善的治療手段和預防方法。可以對計劃懷孕的夫婦進行篩查，倘若夫妻雙方都是攜帶者，可建議在孕中期通過羊水穿刺提取胎兒DNA，進行SMN基因檢測，以明確胎兒是否為患者；也可選擇通過PGD來生育一個健康的胎兒。基因檢測可以為SMA家系提供遺傳咨詢及婚育指導，可進行有效的產前診斷，以減少患兒的出生。