假儉草葉片滲透調節物質含量對冬前低溫的響應及其與低溫傷害的關系

劉南清,林紹艷,沈益新

(1.南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 2124003.南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

假儉草(Eremochloaophiuroides)原產我國，是蜈蚣草屬中唯一可用作草坪草的多年生草本植物[1-2]。假儉草葉形優美，且具有耐旱、耐蔭、耐瘠薄、抗污染、病蟲害少以及容易建植、耐粗放管理等優點，被廣泛用于建植各種類型的草坪，是世界三大暖季型草坪草之一[3-4]。但是，假儉草的耐寒性較差[5]，全年綠色期也較短，在長江下游地區全年綠色期僅220 d左右[6-8]。耐寒性較差和綠色期短是限制假儉草使用的兩個主要因素。因此，改善假儉草的耐寒性對擴大假儉草在長江流域的應用有重要的意義。

一些研究表明，當低溫脅迫發生時，植物細胞內能夠合成一些具有滲透調節作用的保護分子以降低細胞水勢與滲透勢、保持植物水分、穩定體內滲透壓平衡，阻止由于水分的流失引起細胞內冰晶的形成，從而保護植物細胞免受低溫傷害[9]。在草坪植物中，暖季型草坪草耐寒性的高低與寒脅迫過程中其細胞內的滲透調節物質含量有關[10-13]。黃錦文等[14]發現，溝葉結縷草(Zoysiamatrella)和結縷草(Zoysiajaponica)在低溫脅迫下葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均顯著增加。李秋麗等[15]對4個不同的狗牙根(Cynodondactylon)品種進行耐寒性研究，發現抗寒性強的狗牙根品種其匍匐莖中的脯氨酸、總氨基酸及蛋白質含量顯著高于敏感品種。劉湘林[16]、呂優偉等[17]分別人工模擬低溫脅迫海濱雀稗(Paspalumvaginatum)等7種暖季型草坪草種及9種野生早熟禾(Poaannua)，研究發現，隨著低溫脅迫程度的增加，草坪草葉片內的游離脯氨酸和可溶性糖含量逐漸增加，以降低低溫脅迫的傷害。何會蓉等[18]比較了低溫脅迫下6種暖季型草種的生理反應，發現抗寒性較強的假儉草葉片內積累的可溶性糖含量顯著高于耐寒性差的假儉草。黎可華等[19]發現，田間自然低溫脅迫發生時，暖季型草坪草及野生草種體內的可溶性糖含量顯著增加。由此可知，低溫脅迫下，草坪草的耐寒性與其體內滲透調節物質的積累存在密切的相關性，然而，不同的草坪草，或者同種草坪草的不同基因型在寒冷期來臨前或寒冷脅迫發生過程中，其細胞內滲透調節物質在具體的種類與含量上，對低溫的響應可能存在差異，從而導致其耐寒性的差異。

為了明確這種關系，本試驗在田間自然條件下研究了在冬前降溫過程中假儉草葉片內不同滲透調節物質在種類與含量上的變化及其與假儉草耐寒性的關系,試圖確定決定假儉草耐寒性的主要滲透調節物質，以此作為假儉草耐寒性判斷的有效依據，并進一步推進假儉草的耐寒選育工作。

1 材料與方法

1.1 試驗區自然概況

試驗材料種植于江蘇農林職業技術學院草坪草基因庫苗圃地，位于江蘇省句容市邊城鎮江蘇農博園(32°01′34.76″ N，119°14′25.85″ E)，海拔50 m。苗圃地年均溫15.5 ℃，全年無霜期220～240 d，土壤為黃棕壤，pH值為7.6，試驗地土壤肥力中等，地力均勻。

1.2 試驗材料

供試材料共8份，2008年采集于華東與華南各省的野生假儉草種質資源(表1)，種植至試驗地種質資源圃，正常水肥管理，均完全成活并生長良好。

1.3 試驗方法

2013年7月，將8個試驗材料從種質資源圃移栽到試驗小區內，每個小區面積2.5 m×2.5 m，正常水肥管理，試驗材料完全成活并良好生長。試驗在2014年11月7日開始第1次取樣，取樣葉片為第3張完全展開葉(心葉為第一張參照葉片)，之后每隔10 d取樣一次，直至12月17日假儉草葉片基本枯黃時停止取樣。每次取樣時，剪取8個不同基因型假儉草的健康葉片，冰袋低溫保鮮處理帶回實驗室進行生理指標測定。

1.4 指標測定

1.4.1葉色測定 采用目測法測定葉片色澤，評分標準采用草坪草葉片色澤九級評分法。1級分值最低，表示草坪草完全枯黃；9級分值最高，表示草坪草葉片含水量充足，色澤墨綠[20]。

表1 試驗材料的來源情況 Table 1 The collection site for the tested accessions of centipede grass

1.4.2相對電導率測定 采用電導率儀測定。取樣后，將葉片用去離子水沖洗3次，用潔凈濾紙吸干表面水分。葉片剪成0.5 cm的小片段，準確稱取0.5 g，裝入具塞試管。加25 mL去離子水，真空抽氣10 min，振蕩，加塞，在室溫下靜置l h。3次重復。用電導率儀測得電導率值E1。沸水浴10 min，冷卻后測得電導率值E2。3次重復。相對電導率(electrolyte leakage, EL)=E1/E2×100%[21]。

1.4.3丙二醛含量測定 采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malonaldehyde， MDA)含量[22]。剪取葉片鮮樣0.5～1.0 g，在-80 ℃的液氮低溫冷凍后研磨成粉末，加入7 mL磷酸鹽緩沖液(濃度為50 mmol·L-1，pH 7.0)，冰浴中研磨，然后再把提取液放置于4 ℃與13000 r·min-1下離心25 min。所得的上清液與三氯乙酸和硫代巴比妥酸充分反應后，用分光光度計(Spectronic Instruments, New York, NY)在532與600 nm波長下測定吸光值，計算出MDA的含量。

1.4.4可溶性糖含量測定 采用蒽酮比色法測定可溶性多糖(soluble sugar, SS)含量[23]。剪取約1.0 g的假儉草鮮葉，加入液氮研磨成粉末，然后加入1 mL的提取液，再加入1 mL的苯酚，充分振蕩混合，最后加入5 mL的濃硫酸(95%),把混合反應液放入水浴鍋中，在30 ℃水溫下水浴30 min后，取出反應液冷卻15 min。用分光光度計(Spectronic Instruments, New York, NY)在490 nm波長下測定反應液的吸光值。用葡萄糖制作標準校準曲線，根據標準曲線分別計算出葡萄糖(glucose, G)、蔗糖(sucrose, S)與果糖(fructose, F)的含量，進而計算出可溶性多糖(SS)的含量。

1.4.5脯氨酸含量測定 采用茚三酮法測定脯氨酸(proline, Pro)含量[24]。剪取葉片鮮樣約300 mg，放入研缽中，加入液氮研磨成粉末，然后加入5 mL磺基水楊酸進行萃取。將萃取液移到試管中。先后加入2 mL乙酸和2 mL茚三酮進行顯色反應。將試管放置在水浴鍋中沸水浴45 min，取出冷卻。最后往冷卻的反應液中加入4 mL的甲苯完成顯色反應。將上層顯色液在分光光度計測定520 nm波長吸光度。使用L-脯氨酸制作標準曲線作為比色所用的校準曲線。

1.4.6游離態多胺含量測定 根據劉俊等[25]的方法進行腐胺(putrescine,Put)、亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)含量的測定。取0.1 g左右研磨好的葉片干樣粉末，放入離心管中。加入2 mL冷卻后的高氯酸進行多胺的提取。冰浴60 min，然后在12000 r·min-1下離心30 min。將上清液轉入離心管中，冷凍保存在-20 ℃的低溫冰箱。在堿性介質中對上清液中的多胺進行苯甲酰化反應，然后使用二乙醚提取多胺衍生物。醚餾分蒸發干燥，溶解在甲醇中。

使用高效液相色譜儀(HPLC，美國Waltham公司)測定假儉草體內游離態多胺(polyamine, PAs)的含量。色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)。柱溫30 ℃。流動相為甲醇和水(體積比為70∶30)，流速0.7 mL·min-1。檢測波長為230 nm。進樣量10 μL，間隔35 min。標準曲線為Put，Spd和Spm。

1.5 數據處理與分析

采用SAS 9.0對不同基因型間的方差進行分析。用Fisher檢驗法確定基因型間的差異顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 試驗期間的氣溫變化

試驗期間的氣溫變化與常年基本一致(圖1)。從11月7日至11月17日，夜間最低氣溫8 ℃左右；此后，氣溫逐漸降低，11月23日出現初霜，期間有幾天最低氣溫3～5 ℃。11月30日，12月1日、2日和7日，連續輕霜；12月8日至17日期間，夜間最低溫達到-4 ℃。

2.2 冬前草色變化

冬前降溫過程中，假儉草的色澤等級持續下降(圖2)。在11月7日開始采樣時，各基因型葉色等級都在6.5～7.0之間，無顯著差異。降溫過程中，各小區葉色逐漸由綠轉棕黃，黃葉增加。其中，基因型E02、E07、E09、E10的葉色分值高于基因型E01、E04、E05、E08。

圖1 試驗地冬前氣溫變化Fig.1 Changes of temperature in field before winter

圖2 冬前降溫葉片色澤的變化Fig.2 Changes of leaves color of centipede grass before winter

2.3 冬前降溫過程中葉片細胞膜系統透性與丙二醛含量的變化

2.3.1相對電導率 11月17日后，氣溫逐漸降低，假儉草葉片的相對電導率上升；升高趨向在基因型間存在差異(圖3)。11月17日至11月27日之間，出現了最低為3 ℃的低溫天氣，假儉草葉片的相對電導率快速上升，且基因型間差異明顯。E01、E04、E05、E08的相對電導率極顯著高于E02、E07、E09、E10。11月27日至12月7日之間，隨著溫度進一步降低，假儉草葉片的相對電導率上升到47.8%～68.9%，E01、E04、E05、E08的相對電導率極顯著高于E02、E07、E09、E10。12月7日至12月17日期間，最低氣溫為-4 ℃，假儉草葉片大部分枯黃萎蔫，相對電導率繼續上升，各基因型均達到最大值。

2.3.2MDA含量 冬前降溫過程中，假儉草葉片的MDA含量持續升高。11月27日以后，各基因型葉片的MDA含量快速增加，且出現顯著差異。E01、E04、E05、E08的MDA含量顯著高于E02、E07、E09和E10。12月17日取樣結束時，除了E01、E05的MDA含量有輕微下降之外，其他基因型葉片都達到最高值(圖4)。

2.4 冬前降溫過程中葉片滲透調節物質含量的變化

2.4.1脯氨酸含量 隨著氣溫的降低，假儉草葉片的脯氨酸含量先升后降。11月17日開始急劇上升，12月7日到達最高峰，然后稍有回落。整個降溫過程中，不同基因型間脯氨酸的含量差異顯著，E02、E07、E09和E10的脯氨酸含量顯著高于E01、E04、E05和E08(圖5)。

2.4.2可溶性多糖含量 冬前氣溫的下降出現在11月17日，假儉草葉片的可溶性多糖含量隨之急劇上升，12月7日到達最高峰。整個降溫過程中，不同基因型間可溶性多糖的含量差異顯著，可溶性多糖含量由高至低依次為：E10>E02>E09>E07>E05>E01>E04>E08。E02、E07、E09和E10的可溶性多糖含量顯著高于E01、E04、E05和E08(圖6)。

圖3 冬前降溫葉片相對電導率的變化Fig.3 Changes of leaves electrolyte leakage before winter

圖4 冬前降溫葉片MDA含量的變化Fig.4 Changes of leaves MDA content before winter

圖5 冬前降溫葉片脯氨酸含量的變化Fig.5 Changes of proline content before winter

圖6 冬前降溫葉片可溶性多糖含量的變化Fig.6 Changes of soluble sugar content before winter

2.4.3游離態多胺含量 冬前降溫過程中，假儉草葉片的Put含量也隨之變化，但是不同基因型之間表現出明顯差異：E04、E05與E07無明顯變化；E02、E09稍有下降；E01、E08、E10顯著升高(圖7)。

在冬前降溫過程中，假儉草葉片內的Spm含量的變化在不同基因型間差異明顯。E01、 E04與E05無明顯變化；E02、E07、E09、E10顯著升高；E08在11月27日第2次降溫之后，Spm含量才急劇上升(圖8)。

冬前降溫過程中，假儉草葉片內Spd的含量隨著溫度的降低而升高，但是不同基因型間存在顯著差異，E02、E07、E09和E10顯著高于E01、E04、 E05和E08(圖9)。

圖7 冬前降溫葉片腐胺含量的變化Fig.7 Changes of Put content before winter

圖8 冬前降溫葉片精胺含量的變化Fig.8 Changes of Spm content before winter

2.5 冬前的耐寒表現與滲透調節物質含量的相關性分析

圖9 冬前降溫葉片亞精胺含量的變化Fig.9 Changes of Spd content before winter

相關性分析表明，冬前降溫過程中，葉片的EL與MDA存在顯著正相關，相關系數為0.74；EL與SS、Pro、Spm、Spd等極顯著負相關，相關系數分別為-0.83，-0.85，-0.88，-0.91；EL與Put含量的變化相關性不顯著(表2)。MDA的變化與SS、Pro、Spm、Spd等含量也存在顯著或極顯著的負相關，相關系數依次為-0.68，-0.66，-0.83，-0.72；與Put含量的變化無顯著相關性。

表2 降溫過程中假儉草葉片內EL、MDA含量與滲透調節物質含量間相關性比較分析 Table 2 Correlation coefficient among EL, MDA and osmolytes content in leaves of centipede grass

注：* 表示在0.05水平上顯著，**表示在0.01水平上顯著。

Note：* means significant correlation atP<0.05， ** means significant correlation atP<0.01.

3 討論

在本試驗中，當低溫脅迫發生時，假儉草葉色下降，葉片的相對電導率與丙二醛含量快速上升，這3個指標在變化程度上存在顯著的基因型間差異。這表明，低溫脅迫給假儉草葉片造成了外部形態與細胞內部膜系統的傷害，而且傷害程度存在基因型間差異。溫度是影響葉綠素合成與分解的重要因素，低溫可以抑制葉綠素的合成,同時加速葉綠素的分解[26]。低溫脅迫下，葉綠素合成受抑制作用小，分解小，就能保持更好的葉色，也意味著具有更強的耐寒性。相對電導率是用以描述細胞膜損傷程度的一個重要指標。以往在暖季型草坪草的耐寒性研究中發現，低溫傷害導致暖季型草坪草狗牙根、溝葉結縷草、假儉草細胞膜受損，相對電導率上升，其上升速度與暖季型草坪草的耐寒性存在顯著的負相關關系[27]。逆境脅迫發生時，植物細胞中的膜脂氧化加重，丙二醛含量升高。丙二醛含量與包括耐寒性在內的抗逆性存在著負相關關系。在本研究中，假儉草不同基因型間存在顯著的葉色、相對電導率與丙二醛含量的差異，這表明在冬前降溫過程中，假儉草的耐寒性存在顯著的基因型間差異。

在發生水分脅迫和滲透脅迫時，植物細胞主動積累溶質，以降低滲透勢和水勢，維持膨壓，降低傷害。這類溶質統稱滲透調節物質。常見的滲透調節物包括小分子化合物如氨基酸(脯氨酸)、氨基化合物(甜菜堿、多胺等)、可溶性多糖(葡萄糖、果糖與蔗糖)以及一些有機酸(蘋果酸)，同時還包括一些無機離子(鉀離子、鈣離子)[28]。大量的研究表明，植物細胞內滲透調節物質的含量與抗寒性之間有著密切關系。在本實驗中，當冬前低溫脅迫發生時，假儉草葉片的可溶性多糖、脯氨酸、游離態多胺等滲透調節物質的含量隨之快速增加。這表明，低溫脅迫下，假儉草可以快速在葉片細胞內積累各類滲透調節物質，以此抵御低溫傷害。

許多研究者發現，低溫脅迫下，植物體內會積累大量的脯氨酸以應對冷脅迫[29-31]，脯氨酸是植物體內一種最有效的滲透調節物質。在草坪草的耐寒性研究中，低溫脅迫同樣會導致草坪草體內積累大量的脯氨酸[14]。有研究發現，在寒脅迫下，溝葉結縷草(Z.matrella)、結縷草與假儉草體內的脯氨酸含量都會極顯著地增加[32-33]。本研究中，假儉草各基因型葉片內的脯氨酸含量隨著低溫脅迫的加重而快速增加，且耐寒性較強的基因型，脯氨酸含量顯著高于耐寒性較差的基因型。因此，脯氨酸是假儉草細胞內與抗寒性相關的重要滲透調節物質之一。

可溶性多糖可以作為植物細胞的滲透調節物質和防脫水劑而起作用，可以降低細胞的水勢并增強其持水力[34-36]。在低溫脅迫發生時，植物可以通過積累大量的可溶性多糖來降低寒害。以往對暖季型草坪草的耐寒性研究發現，在寒脅迫下，野牛草(Buchloedactyloides)、鹽草(Distichlisspicata)和結縷草細胞積累較多的果糖可以提高抗寒性[37-39]。低溫條件下，狗牙根品種‘Flora Drawf’比‘Tifdrawf’積累了更高濃度的可溶性多糖而表現出更強的抗寒性和早春返青能力[10]。在本研究中，當冬前低溫脅迫發生時，假儉草葉片內的可溶性多糖隨著溫度的下降而大幅度增加，而且隨著降溫加劇，可溶性多糖含量增加。試驗還發現，在低溫脅迫條件下，耐寒性強的假儉草基因型其葉片內的可溶性多糖含量顯著大于耐寒性差的基因型，可溶性多糖的含量與假儉草的耐寒性呈極顯著正相關。這表明，可溶性多糖是假儉草體內與耐寒性關系密切關聯的另一類滲透調節物質。

多胺對植物細胞的滲透調節、細胞膜穩定性、自由基清除以及氣孔運動的調節等起著重要作用。植物體內的游離態多胺包括腐胺、亞精胺與精胺。以往的研究發現，低溫脅迫能導致植物內源多胺水平上升，但是不同的植物累積的多胺種類并不一致[40]。在寒脅迫下，小麥體內的Put含量與其耐寒性呈正相關[41]。耐寒品種的水稻秧苗根部與芽中的Put、Spm和Spd的含量在寒脅迫發生時都急劇增加[42]。過表達CdSAMDC的轉基因假儉草不需經過冷馴化就可提高抗凍性的機理可能與其較高的精胺和亞精胺含量有關[43]。在本研究中，當冬前低溫脅迫發生時，假儉草葉片內的各種多胺物質在含量上與變化上都表現出明顯的差異。整個冷脅迫過程中，假儉草葉片內的Put與Spm不僅含量小，而且變化幅度不明顯； Spd的含量則遠遠大于Put及Spm的含量，并且，隨著溫度的降低，冷脅迫的加重，假儉草葉片內Spd的含量迅速大幅度上升。相關性分析同樣表明，假儉草葉片的EL及MDA含量與Spd的含量存在顯著的負相關關系。這表明，低溫脅迫能導致假儉草葉片內Spd的快速大量積累，其含量越高，積累速度越快，則意味著假儉草的耐寒性越強。Spd是假儉草應對低溫脅迫的主要多胺類物質。

4 結論

綜上所述，隨著冬前降溫，低溫脅迫的發生，假儉草的葉色降低，葉片內相對電導率與丙二醛含量快速上升，假儉草出現了低溫傷害。與此同時，假儉草快速在葉片細胞內積累脯氨酸、可溶性多糖以及多胺等滲透調節物質，以此抵御低溫傷害。低溫傷害的程度以及滲透調節物質的積累量因基因型的不同而表現不同。在低溫脅迫下，耐寒性強的基因型在葉片內的脯氨酸、可溶性多糖、精胺以及亞精胺的積累量顯著高于耐寒性差的基因型。因此，低溫脅迫下，假儉草葉片內的脯氨酸、可溶性多糖、精胺以及亞精胺的含量，可以作為評價假儉草耐寒性的重要指標。