高效液相色譜-原子熒光法測定水產品中無機砷含量

孟春英，張小軍，黃麗英，顧 捷

(浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316021)

砷(As)是一種廣泛存在于自然界中的類金屬元素[1]，砷及其化合物在農業上常用作殺蟲劑，工業生產中用于皮毛的防腐、脫毛，玻璃的脫色劑等。隨著工業化生產的不斷發展，砷的污染日益加劇，其污染源主要為飲用水、食品中的累積，對人類的身體健康威脅越來越大[2]。

砷的毒性大小與其存在的形態密切相關[3]。毒理學研究表明，無機砷的毒性大于有機砷，As(III)比As(V)的毒性強。As(III)化合物易被細胞吸收和蓄積，阻礙細胞呼吸、分裂和增殖，從而導致細胞死亡等[4]。慢性砷中毒會使神經功能紊亂，致癌、致畸形等[5-6]。常見的分離技術包括高效液相-原子熒光光譜(HPLC-AFS)[7-8]和高效液相-電感耦合等離子體質譜儀(HPLC-ICP-MS)[9-11]等。HPLC 分離能力高，AFS 儀器設備價格低，其線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高、操作簡單，所以HPLC-AFS 聯用技術應用更廣泛。本研究以HPLC-AFS 聯用技術測定水產品中無機砷的形態和含量，對GB 5009.11-2014[12]中前處理方法做了改進，縮短了前處理時間，提取條件更溫和，雜質干擾少，獲得的峰形尖銳。同時以該方法測定了2016 年浙江省324 批次樣品中無機砷含量，客觀了解浙江省水產品中無機砷含量情況，以期為監測水產品中無機砷含量提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來自浙江溫州的養殖企業及該區域的自然海域捕撈產品包括貝類、蟹類、蝦類和魚類等。樣品制備和保存按照SC/T 3016-2004《水產品抽樣方法》[13]進行。

1.2 儀器與設備

主要包括ProStar210 液相色譜泵(美國Varian 公司)；SA-10 原子熒光形態分析儀(配SAP-10 形態分析預處理裝置，北京吉天儀器有限公司)；砷空心陰極燈(北京有色金屬研究總院HAF-2)；陰離子交換色譜柱(美國Hamilton 公司，PRP-X100，250×4.1 mm，10 μm)；AL204 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；IKA T18 基本型漩渦振蕩器(德國IKA 公司)；Centrifuge 5810 臺式高速離心機(德國艾本德公司)；pH計(德國Sartorius PB-10)等。

1.3 材料與試劑

砷酸根(AsO43-)溶液標準物質(GBW08667)，質量摩爾濃度(0.233±0.005) μmol·g-1；亞砷酸根(AsO33-)溶液標準物質(GBW08666)，質量摩爾濃度(1.011±0.016) μmol·g-1；一甲基砷(MMA)溶液標準物質(GBWO8668)，質量摩爾濃度(0.335±0.011) μmol·g-1二甲基砷(DMA)溶液標準物質(GBWO8669)，質量摩爾濃度(0.706±0.024) μmol·g-1均來自中國計量科學研究院。甲醇(色譜純，Merck)；硝酸(色譜純，Merck)；鹽酸(優級純)；磷酸氫二銨(色譜純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀為分析純。

1.4 無機砷形態分析方法

1.4.1 砷標準儲備液的制備

將MMA 溶液標準物質、DMA 標準溶液物質、AsO33-標準溶液物質及AsO43-標準溶液物質分別轉移至5 mL 的容量瓶中，純水定容至5 mL，其濃度分別為9.67、22.05、29.39、7.04 μg·mL-1，密封保存于4℃冰箱中，有效期3 個月。

1.4.2 無機砷混合標準使用液的配置

依次準確移取517、227、170、710 μL 的MMA 標準儲備液、DMA 標準儲備液、AsO33-標準儲備液和AsO43-標準儲備液于5 mL 容量瓶中，純水稀釋至5 mL，使各組分的最終質量濃度均為1.0 μg·mL-1，現用現配。

1.4.3 樣品提取

稱取1.0 g 左右大黃魚Larimichthys crocea 濕樣于50 mL 離心管中，加入0.15 mol·L-1硝酸溶液20 mL，渦旋混勻2 min 后于50℃振蕩過夜，取出冷卻至室溫，2 657 g 離心6 min，取5 mL 上清液于15 mL離心管中，加入5 mL 正己烷振蕩1 min，去除脂質成分，再次離心(條件同上)，離心后棄去上層正己烷，吸取下清液，過0.45 μm 有機濾膜，待用。

1.4.4 樣品測定

選取色譜柱Hamilton PRP-X100(柱長250 mm，內徑4 mm)；流動相15 mmol·L-1的磷酸氫二銨(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1；柱溫25℃，手動進樣100 μL。

形態分析預處理裝置參數設置：泵速65 r·min-1；載流7% HCl；還原劑0.5% KOH+1.5% KBH4。

氫化物發生條件：元素燈電流80/45，負高壓285 V，載氣(氬氣)流速400 mL·min-1；屏蔽氣(氬氣)流速600 mL·min-1。

1.5 標準曲線及方法檢出限

砷形態測定曲線：配置1.0 μg·mL-1含MMA、DMA、AsO33-和AsO43-的4 種砷形態混標使用液，用純水稀釋成0、5、10、20、30、50、100 ng·mL-1系列標準溶液，供HPLC-AFS 分析，保留時間定性，峰面積定量。以峰面積為縱坐標，無機砷濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.6 質量控制

選用外標法，在待測樣品中加入適量的混合標準使用液，做3 個平行，計算加標回收率和平行樣之間的RSD，驗證方法的準確度和精密度。

1.7 無機砷含量計算方法

樣品中無機砷的含量是亞砷酸根和砷酸根含量的加和。單種形態含量計算公式見式(1)：

式(1) 中ρ-單種待測物的含量，mg·kg-1；c-提取液中單種待測物的含量，μg·L-1；V-提取液定容體積，mL；m-樣品的稱取量，g；n-稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 色譜及光譜條件優化

流動相15 mmol·L-1的磷酸氫二銨(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1，色譜柱選用Hamilton PRP-X100；泵速65 r·min-1，載流7% HCL，還原劑0.5%KOH+1.5%KBH4；元素燈電流80/45，負高壓285 V，載氣(氬氣)流速400 mL·min-1；屏蔽氣(氬氣)流速600 mL·min-1。混合標準溶液的色譜圖如圖1 所示。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 前處理優化

圖1 混合標準溶液中4 種砷形態色圖譜Fig.1 Chromatogram of 4 kinds of arsenic forms in standard solution

本研究對GB 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》中的前處理進行了部分改進，以50℃恒溫振蕩過夜的處理方法代替國標中樣品室溫放置過夜然后90℃恒溫箱中熱浸提2.5 h 的處理方法，前處理條件更溫和，避免了90℃高溫處理2.5 h，此舉可以更好的保護砷的形態，避免各砷形態間的相互轉化；每批次樣品前處理時間可縮短2.5 h，提高了檢測效率。

2.2.2 優化結果

同一陽性樣品提取值RSD 在2.01%～4.31%。在同一實驗條件下，經GB 中前處理方法處理后，As(V)的加標回收率67%～85%，鋒形拖尾；經本研究中前處理后，As(V)的加標回收率85%～99%，且鋒形較尖銳。

2.3 基質效應的影響

由于基質效應的影響，在實際樣品檢測中各形態的保留時間和標準品的保留時間會有0～10%的漂移，且DMA 和AsO33-的保留時間非常接近，為了更準確的辨別樣品中的砷形態，方法中應該加入MMA 和DMA；其次考慮到MMA 和DMA 也具有輕微毒性，也應該監測樣品中MMA 和DMA 的含量，使檢測結果更科學準確。

2.4 方法學評價

2.4.1 方法的線性范圍、回歸方程與定量限

以砷混合標準溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，2 種砷形態標準溶液線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限如表1，檢出限以3 倍信噪比的方法計算得出，定量限以10 倍信噪比計算。

表1 無機砷測定的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限Tab.1 Linear range,regression equations,correlation coefficients,limits of detection of inorganic arsenic

2.4.2 回收率和精密度

稱取樣品于50 mL 離心管中，先加入0.6 mL 的4 種砷形態的混合標準使用液，再加入0.15 mol·L-1的硝酸溶液定容至20 mL，做3 個平行。3 次測定的加標回收率：As(III)的均值為98%，RSD 為2.16%；As(V)的均值為95%，RSD 為2.75%；表明2 種形態的無機砷測定數值均在規定范圍內，方法的準確度和精密度可以滿足檢測的要求。樣品加標色譜圖如圖2 所示。

圖2 樣品加標色譜圖Fig.2 Chromatogram of spiked sample

不同形態的砷的毒性存在很大差異，所以對不同砷形態的研究很有必要。邱宗清等[14]用陰離子交換色譜-ICP-MS 法測定了福建花蛤中的砷形態，1.00 mmol·L-1(NH4)2CO3和10.00 mmol·L-1的(NH4)2HPO4梯度洗脫，砷甜菜堿(ASB)、MMA、DMA、As(III)和As(V)在15 min 內分離開。而吳思霖等[15]選用HPLC-AFS 聯用技術測定水產品中的無機砷，采用1 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 9.0)、20 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 8.0)，色譜柱Hamilton PRP-X100，20 min 內將MMA、DMA、As(III)和As(V)分離開。還有部分學者選用等度洗脫，如周秀清[16]選用15.00 mmol·L-1的NH4H2PO4(pH 10.0)為流動相，將As(III)、As (V)、ASB 和MMA 在9 min 內分開，使用儀器為HPLC-ICP-MS，色譜柱為Hamilton PRP-X100。HPLC-AFS[17]聯用技術分離海藻中的無機砷，也用等度洗脫，流動相為15 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 6.0)，色譜柱同上，12 min 內將MMA、DMA、As(III)和As(V)分離開。綜上所述，多數研究中無機砷的分離多選用陰離子交換柱，流動相多為磷酸鹽，流動相pH 影響各形態的出峰順序及分離度。但存在的共同問題是As(V)峰形較其他3 種差，推測原因是As(V)通常是最后一個出峰，保留時間較長，對峰形有一定影響。這一點還有待驗證。

2.5 檢測樣品測定

結合2016 年浙江省常見水產品中國無機砷的監測數據，本研究對采自浙江溫州養殖企業及近海海域的324 個樣品的無機砷含量進行分析[18]，具體數據如表2。

表2 檢測樣品中無機砷測定結果Tab.2 Determination results of inorganic arsenic in aquatic products

由表2 見，324 個樣品中67 個樣品有無機砷檢出，檢出率為20.7%。泥蚶Tegillarca granosa 的檢出率為18.1%(最高含量為0.39 mg·kg-1)；縊蟶Sinonovacula constricta 檢出率為63.0%(最高含量為1.79 mg·kg-1)，有2 個樣品(比例為7.4%)無機砷含量超標；青蛤Cyclina sinensis 的檢出率為65.6%(最高含量為0.17 mg·kg-1)；厚殼貽貝Mytilus coruscus 共3 個樣品，均有檢出(最高含量為0.068 mg·kg-1)；遠海梭子蟹Portunus pelagicus 的檢出率為26.9%(最高含量為0.49 mg·kg-1)；海捕蝦、槍烏賊Loligo chinensis、中華鱉Trionyx sinensis 和魚均未檢出。總體來說，貝類無機砷含量最高。

圖3 貝類中無機砷含量Fig.3 The content of inorganic arsenic in shellfish

從圖3 可以看出，縊蟶中無機砷含量最高，范圍0.03～1.79 mg·kg-1，均值為0.3 mg·kg-1，分別是泥蚶，青蛤，貽貝的3.6、3.8、6.3 倍。其次為泥蚶，范圍0.03～0.12 mg·kg-1，均值為0.08 mg·kg-1，貽貝含量最低。關于貝類中砷的研究較多。郝云杉等[19]2010 年在浙江省舟山市主要菜場中采集了菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、縊蟶、牡蠣和貽貝4 種貝類并研究無機砷的含量，發現貝類無機砷含量范圍在0.07～0.19 mg·kg-1，菲律賓蛤仔含量最高，縊蟶次之，牡蠣第3，貽貝最低。李學鵬等[20]研究了2006 年杭州市近江市場幾種食用貝類中重金屬含量，包括牡蠣、菲律賓蛤仔、文蛤Meretrix meretrix和泥蚶，無機砷含量最高的是菲律賓蛤仔(0.78 mg·kg-1)，全部樣品的無機砷含量范圍在0.11～0.84 mg·kg-1，均值為0.42 mg·kg-1。程家麗等[21]從2001-2015 年發表的文獻中收集了中國海洋食用貝類重金屬含量數據，報道的區域從海南沿海至大連沿海，包括長江口-浙江沿海、山東沿海、珠江口、渤海灣、福建沿海幾大海域，比較了牡蠣、菲律賓蛤仔、縊蟶及貽貝中總砷的含量，縊蟶中總砷含量最高(2.14±3.97) mg·kg-1，貽貝最小(1.2±0.83) mg·kg-1。通常貝類中無機砷的含量約為總砷含量的10%[22]，因此基于獲得的數據，縊蟶中無機砷含量約為(0.214±0.397) mg·kg-1，與本研究評估2016 年浙江省貝類中縊蟶無機砷含量最高的結論一致。孫慧玲[23]2013-2014 年在大連主要水產品市場采集了4 種貝類(長牡蠣Crassostrea gigas、蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis、縊蟶和中國槍烏賊)，分析其體內重金屬的含量，發現縊蟶體內的砷含量最高，且其含量顯著高于蝦夷扇貝和中國槍烏賊。王玲等[24]研究了三門灣海域水產品中的重金屬含量發現貝類中砷含量高于甲殼類和魚類。貝類產品對無機砷的富集能力要高于魚蝦類。這可能是由于貝類生活在底泥中，而重金屬在底泥中的含量由于累積作用往往比相應的水體中的含量要高得多[25-26]。也有可能是因為貝類為濾食性生物，對污染物的釋放和代謝比魚類和甲殼類慢，對重金屬的富集程度高[27-28]。重金屬在體內代謝慢，易積累，所以沿海地區貝類的監管應當受高度重視。

3 結論

本研究選用15 mmol·L-1(pH 6.0)的磷酸氫二銨在8 min 內將DMA、MMA、As(III)和As(V)分離開，加標回收率在80%～99%之間，RSD 范圍為1.82%～2.75%。此方法可以滿足檢測的要求。實際檢測過程中，該方法前處理條件溫和，時間短，As(III)和As(V)的峰形尖銳，出峰時間穩定，重復性良好，加標回收率和RSD均在要求的范圍內。檢測的324 個樣品，無機砷檢出率為20.7%，其中95.6%的樣品只含As(III)，4.4%的樣品含As(III)和As(V)。貝類的檢出率最高，縊蟶體內的無機砷含量最高，超標率為7.4%。建議沿海地區的水產品無機砷監管應當受高度重視貝類，至于貝類無機砷含量能否反映出環境中砷含量的關系還需進一步研究。