武夷巖茶粗老葉酶法提取高含量游離氨基酸水提液的工藝研究

張婷婷，張賓樂，廖秀玲，廖素蘭

（1.武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

武夷巖茶是深受國人們喜愛的茶類，是中國烏龍茶的珍品[1]，屬于中國十大名茶之一。茶葉中含有豐富的氨基酸，是構成茶葉滋味的重要成分，也是武夷巖茶品質鑒定中的一個重要理化指標，直接影響茶葉的品質[2]。茶葉的游離氨基酸（free amino acids，FAA）指茶葉水浸出物中呈游離狀態存在，非蛋白質態的可溶性氨基酸[3]，其含量對武夷巖茶的滋味、香氣、藥理和營養作用等有很大的影響[4]。武夷巖茶在制作過程中，挑選出成品茶后會剩余大量的粗老葉、茶梗等下腳料，造成環境污染[5]。其中粗老葉的營養價值及風味成分最多，只略低于成品茶，因此被丟棄過于浪費。傳統的普通浸提法很難完全浸提出茶葉中的營養成分和風味物質，且高溫提取會使茶葉中很多風味物質揮發，失去香氣。由于浸提條件很大程度上影響著茶葉浸出物的色、香、味等品質[6]，近年來，一些物理浸提技術逐漸成熟，如微波浸提、超聲波浸提，超高壓浸提等，但由于成本較高，因此目前國內更側重采用化學提取法或物理化學結合的方法浸提茶湯[7]。酶制劑用于速溶茶生產時茶湯的浸提，具有高效、節能、環保等特點[8]。纖維素酶能分解茶葉細胞壁，使細胞結構破壞，從而促進茶葉中有效成分的擴散和浸出，有利于固形物的溶出和浸提率的提高；蛋白酶能水解茶葉中的蛋白質，能提高茶湯中的氨基酸含量，增強茶湯鮮爽的口感[9]，將這兩種酶復合提取可起到事半功倍的效果。因此，該試驗選用武夷巖茶的粗老葉為原料，采用復合酶法浸提，以水提物中游離氨基酸總量為考察指標，篩選最優的浸提工藝參數，提高水提液的營養價值及風味，為下一步茶飲料、速溶茶粉等茶產品的生產和研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

武夷巖茶下腳料（粗老葉）：武夷山清風澗巖茶廠；纖維素酶（5×104U/g）：寧夏和氏璧生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（1×105U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；茶氨酸標準品、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、水合茚三酮、氯化亞錫（均為分析純）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設備

PW80萬能高速粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AR522CN電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市鴻科儀器廠；SHZ-DIII循環式真空水泵：鞏義市予華儀器有限公司；V-1100D型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

巖茶粗老葉→粉碎→加酶浸提→滅酶→抽濾→水提液→理化測定

1.3.2 操作要點

1）粉碎：取一定量的巖茶粗老葉，粉碎至一定細度，過40目篩備用；

2）加酶浸提：稱取2.000 g過篩的茶碎末于250 mL錐形瓶中，加入一定量蒸餾水、纖維素酶和木瓜蛋白酶。調節pH值為7，置于恒溫水浴鍋中，控制一定溫度和時間進行浸提；

3）滅酶：至于100℃恒溫水浴鍋中滅酶5 min；

4）抽濾：將酶解液真空抽濾，分離出茶渣，將得到的水提物移到100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻待測。

1.3.4 游離氨基酸總量的測定

采用GB/T8314-2013《茶游氨基酸總量的測定》[10]中的茚三酮比色法，繪制氨基酸標準曲線，并測定水提液中的游離氨基酸總量。

1.3.5 單因素試驗設計

1.3.5.1 纖維素酶與木瓜蛋白酶復配比例的確定

纖維素酶與木瓜蛋白酶分別以酶活力比1∶9、3∶7、5 ∶5、7 ∶3、9 ∶1（U/U）復配。其余參數為：總加酶量500 U/g、浸提時間40 min、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.2 總加酶量的確定

總加酶量分別設定為 250、500、750、1000、1250 U。其余參數為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力5∶5（U/U）復配、浸提時間40 min、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.3 浸提溫度的確定

浸提溫度分別設定在 30、40、50、60、70℃。其余參數為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復配、總加酶量500 U、浸提時間40 min和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.4 浸提時間的確定

浸提時間分別設定為 10、20、30、40、50 min。其余參數為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復配、總加酶量500 U、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.5 料液比的確定

料液比分別設定為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）和1∶30（g/mL）。其余參數為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復配、總加酶量500 U、浸提時間40 min和浸提溫度50℃。

1.3.6 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取較優的因素水平范圍，設計四因素三水平正交試驗。

2 結果與分析

2.1 氨基酸標準曲線

以氨基酸（以茶氨酸計）濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 氨基酸標準曲線Fig.1 Amino acid standard curve

如圖1所示，線性回歸方程為：y=2.984x-0.067 8，R2=0.998 8，茶氨酸對照品吸光值與其濃度線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 復合酶配比對FAA總量的影響

以纖維素酶與木瓜蛋白酶的復配比例為橫坐標，FAA總量為縱坐標，繪制柱形圖，如圖2所示。

圖2 復合酶配比對水提液中FAA總量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme ratio on total FAA content in water extract

纖維素酶通過分解植物的細胞壁從而釋放其中的有效成分，木瓜蛋白酶對其中蛋白質進行水解。茶葉中蛋白質含量約占其干物質含量的15%～30%，絕大多數為非水溶性蛋白，而水溶性蛋白只占2%[11-12]。這兩種酶復合，會對相互的酶解反應產生增效作用。由圖2可知，當復合酶配比（U/U）為5∶5時，水提液中游離氨基酸總量最高。游離氨基酸的產生主要依靠蛋白酶對茶葉中水溶性和非水溶性蛋白的降解，蛋白酶含量不足，則降解產物——游離氨基酸總量下降。而纖維素酶分解茶葉的細胞壁，能有助于茶葉中非水溶性蛋白暴露，被蛋白酶降解，因此，纖維素含量不足，游離氨基酸總量也下降。綜上所述，纖維素與木瓜蛋白酶的最佳復配比例為酶活力比5∶5（U/U）。

2.2.2 總加酶量對FAA總量的影響

以總加酶量為橫坐標，FAA總量為縱坐標，繪制曲線圖，如圖3所示。

圖3 總加酶量對水提液中FAA總量的影響Fig.3 Effect of total enzymatic addition on total FAA content in water extract

由圖3可知，隨著加酶量的增加，游離氨基酸總量逐漸升高。當總加酶量為250 U～1 000 U時，游離氨基酸總量明顯上升，說明在這個區域內，底物分子與酶有很好的結合度，隨著加酶量的升高，酶解產物增多。當加酶量為1 000 U時，游離氨基酸總量接近最高值，大于1 000 U之后，游離氨基酸總量無明顯上升，這是由于加酶量已經超出了底物濃度，再增加亦對酶解反應也無明顯作用。因此，從成本考慮，總加酶量在1 000 U為宜。

2.2.3 浸提溫度對FAA總量的影響

以浸提溫度為橫坐標，FAA總量為縱坐標，繪制曲線圖，如圖4所示。

圖4 浸提溫度對水提液中FAA總量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total FAA content in water extract

酶在最適溫度范圍內活性最強，酶促反應速度最快，且資料表明纖維素酶與木瓜蛋白酶的最適溫度范圍相近[13-14]，因此該試驗直接對復合酶的最適溫度作研究。由圖4可知，當溫度低于50℃時，酶活性被抑制，隨著溫度升高，游離氨基酸總量逐漸上升，達到50℃時游離氨基酸總量最高。超過50℃時，酶活性下降，曲線明顯下降，且溫度過高，酶屬于蛋白質，易發生變性。因此，該復合酶的最佳酶解溫度在50℃為宜。

2.2.4 浸提時間對FAA總量的影響

以浸提時間為橫坐標，FAA總量為縱坐標，繪制曲線圖，如圖5所示。

圖5 浸提時間對水提液中FAA總量的影響Fig.5 Effect of extraction time on total FAA content in water extract

由圖5可知，隨著浸提時間的延長，游離氨基酸總量逐漸上升，在20 min前，上升速度較快，這說明游離氨基酸分子質量較小，能夠很快的溶出[15]；20 min后，游離氨基酸總量上升緩慢，說明20 min對于大部分的底物能夠與復合酶發生酶解反應，20 min后繼續酶解浸提，游離氨基酸總量雖仍在上升，但速率開始減緩。因此從成本考慮，浸提時間以20 min為宜。

2.2.5 料液比對FAA總量的影響

以料液比為橫坐標，FAA總量為縱坐標，繪制柱形圖，如圖6所示。

圖6 料液比對水提液中FAA總量的影響Fig.6 Effect of the ratio of material to liquid on total FAA content in water extract

料液比對水提液中FAA的影響表現為：一方面隨著溶劑的增加，有助于溶質FAA的浸出，但另一方面若溶劑過多，會對底物和酶起到稀釋作用，而降低酶解反應的速率。由圖6的試驗結果可以看出，在料液比 1∶25（g/mL）前，隨著溶劑的增加，FAA 在水提液中的浸出量逐漸上升；料液比 1∶10（g/mL）時，浸提出的FAA總量最低，此時底物濃度偏高，酶不足以充分與底物結合；當料液比為1∶25（g/mL）時，底物與酶的濃度相當，降解出的游離氨基酸總量最高；溶劑繼續增加，則底物和復合酶被稀釋，酶解速率下降，游離氨基酸總量下降，因此最佳料液比以1∶25（g/mL）為宜。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗得出的結果，從中選取最優的因素水平范圍，做進一步優化，設計正交試驗表，如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗設計表Tabel 1 L9（34）orthogonal experimental design table

根據表1的正交設計進行組合試驗，得出的試驗結果如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗結果Tabel 2 L9（34）orthogonal experimental results

由表2的正交試驗結果可知，對試驗結果影響的顯著性由高到低依次為：C（酶解時間）>D（料液比）>A（總加酶量）>B（酶解溫度）。根據k值篩選出最優的浸提工藝組合為A2B2C3D1，即總加酶量1 000 U；酶解溫度 50 ℃；酶解時間 25 min；料液比 1∶22（g/mL），該組合恰好為正交試驗組合的第5組。因此，采用正交優化的最優工藝浸提巖茶粗老葉，得到的水提液中游離氨基酸含量為26.97%。

3 結論與討論

3.1 結論

本研究得出了采用木瓜蛋白酶和纖維素酶兩種酶復合，從武夷巖茶下腳料——粗老葉中浸提高含量游離氨基酸水提液的最優工藝。得到的水提液中游離氨基酸含量為26.97%，與傳統的水浴加熱或超聲輔助法等相比[16]，顯著提高了游離氨基酸的溶出率，有助于提高茶產業的經濟效益。

3.2 討論

早年就有關于速溶茶的酶法提取工藝研究，但發展較慢，如今酶在各行業都被廣泛應用和關注，因此今后速溶茶的發展勢必會向著酶法提取技術研究靠攏[17]。

本試驗采用纖維素酶和木瓜蛋白酶的復合酶從武夷巖茶下腳料——粗老葉中酶解浸提水提物，先采用纖維素酶分解茶葉細胞壁中的纖維素，生成水溶性糖，并使細胞內容物更好地釋放出來，再利用蛋白酶分解其中的蛋白質，產生水溶性氨基酸，浸出至茶湯中，更大程度地保留了茶葉的營養成分和風味物質。游離氨基酸是影響茶飲品的風味和營養價值的主要物質，本研究是為武夷巖茶及其下腳料的浸提工藝研究提供了參考，對提高茶產業經濟效益及下一步的高氨基酸茶飲品、速溶茶粉等茶產品的生產和研發提供參考依據。