不同部位“雪花”梨所釀梨酒中酚類物質的分析和抗氧化能力比較

李麗梅，馮云霄，何近剛，程玉豆，關軍鋒

（河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

酚類物質是果酒的重要組成部分，賦予果酒復雜的口感和味感特征[1]，同時具有抗氧化的生理功能[2]，葡萄酒中多酚類物質具有極強的抗氧化、抗菌與預防心腦血管疾病等生理功效[3]。對果酒自身還具有抑菌[4]、抗氧化和澄清的作用[5]，便于果酒的保存和品質改善。關于果酒酚類物質的研究主要集中在葡萄酒方面，內容涉及分析[6-8]、種植環境[9]、采收期[10]、酵母[11]、提取方法[12]、發酵條件[13]等因素對酚類物質含量的影響。而關于梨酒的酚類物質則鮮有報道。梨和葡萄自身的酚類物質種類和含量有差異[14-17]，可能造成梨酒和葡萄酒中的酚類物質不同。目前尚未見到報道梨酒的酚類物質含量和種類以及對梨酒品質的影響，因此本研究以“雪花”梨為試驗材料，以全果、皮肉和果肉分別榨汁后釀制梨酒，探討不同部位對梨酒中酚類物質含量和種類的影響，為原料選擇和優化梨酒的釀制工藝提供理論依據。“雪花”梨是河北省的特有品種，栽培面積大，產量高。但隨著新品種梨的不斷引種和推廣，消費者對“雪花”梨的消費量逐年下降，銷售市場低迷，梨賤傷農，農民的種植積極性極大受挫，給河北省梨產業帶來不利的影響。為了保護“雪花”梨這一地方品種，需要為其銷售尋找新的突破口。開展釀酒研究將有利于“雪花”梨種植業的發展，增加農民收入，具有重要的社會和經濟效益。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新鮮“雪花”梨于成熟期采摘自河北省趙縣范莊“雪花”梨種植基地。

酵母RC212：法國LAFFORT公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：J&KScientificLTD；熊果苷（純度≥98%）、沒食子酸（純度≥98%）、綠原酸（純度≥98%）、（+）-兒茶素（純度≥98%）、p-香豆酸（純度≥98%）、槲皮素（純度≥98%）、原兒茶酸（純度≥98%）標準品：北京索萊寶科技有限公司；咖啡酸（純度≥98%）、表兒茶素（純度≥98%）、蘆丁（純度≥98%）標準品：北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2100分光光度計：美國Unico公司；L-2000高效液相色譜儀（配備L-2400 UV檢測器，Lachrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本 Hitachi公司；3K30高速離心機：美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 梨酒釀制

分別取全果（剔除種子）、皮肉和果肉榨取果汁，調整糖度至22°Brix，接種酵母RC212，進行酒精發酵，待糖度不再下降時發酵結束，倒罐，靜置，自然澄清，得到3種不同的梨酒，分別命名為WFW、PFW和FW。

1.3.2 酚類物質分析

新鮮“雪花”梨采收后分別取全果（剔除種子）、皮肉和果肉立即榨取果汁（分別依次命名為WFJ、PFJ和FJ），10 000×g離心 10 min，取上清液過 Cleanert C18-SPE固相萃取小柱（提前以色譜純甲醇潤洗），然后用色譜純甲醇沖洗，收集淋洗液搖勻，過0.45 μm極性濾膜后，取10 μL進樣，進行高效液相色譜法（high performance liquid chromatograph，HPLC）進行分析。酒液的HPLC分析前的處理方法同果汁。

酚類物質分析參考李麗梅等[14]的方法。色譜條件：HITACHI L-2000高效液相色譜儀器自帶的反相LachromC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫30℃，流動相為5%冰醋酸水溶液（A）、乙腈（B）。采用梯度洗脫程序，洗脫程序為0～20 min，5%～15%B，21min～40min，15%～45%B，流速為 1.0mL/min，進樣體積為 10 μL。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定

參考Takako等[18]的方法。

式中：S為DPPH自由基清除率，%；A0為DPPH甲醇溶液的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.4 數據分析

采用統計分析軟件JMP11.0對試驗數據進行顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 酚類物質分析

通過與標準品比對，共分離鑒定出10種酚類物質見表1，按出峰時間排序，依次是3，4-二羥基苯丙氨酸、熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、蘆丁和槲皮素。

表1 不同部位“雪花”梨榨取梨汁的酚類物質比較Table 1 Comparison of phenolic among different juice from'Xuehua'Pear

梨果汁中酚類物質的總量從高到低依次是WFJ、FJ和PFJ。其中WFJ中熊果苷的含量最高，為83.29μg/mL，綠原酸、蘆丁次之，分別為18.40μg/mL和14.10μg/mL，原兒茶酸含量為 7.26 μg/mL，3，4-二羥基苯丙氨酸、沒食子酸和兒茶素3種酚類含量接近，約4 μg/mL～5 μg/mL，表兒茶素和槲皮素含量在 1μg/mL～2 μg/mL，咖啡酸的含量不足0.5 μg/mL。PFJ中各酚類物質含量排序和WFJ相同，但含量低于后者。FJ的酚類物質和WFJ和PFJ差異較大，表現為綠原酸的含量最高，為58.55 μg/mL，熊果苷次之，為 38.26 μg/mL，蘆丁和兒茶素分別為 11.87 μg/mL 和 8.28 μg/mL，原兒茶酸含量為4.86 μg/mL，沒食子酸含量為 3.35 μg/mL，3，4-二羥基苯丙氨酸含量為2.36 μg/mL，表兒茶素和槲皮素含量接近，分別為 1.26 μg/mL 和 1.17 μg/mL，咖啡酸的含量不足 0.5 μg/mL。

果汁釀制成梨酒后，總酚含量都有不同程度下降。其中WFW和FW分別較果汁下降了20.4%和21.3%，PFW較果汁下降了27.6%，說明發酵過程中酚類物質總量有所損失，以PFW下降幅度最大。WFW的總酚含量最高，FW次之，而PFW的總酚含量最低見表2。

在WFW和PFW中所含的酚類中，熊果苷的含量均最高，分別是 51.04 μg/mL 和 38.26 μg/mL，兒茶素和3，4-二羥基苯丙氨酸含量在WFW中分別排第二和第三，而在PFW中則分別位列第三和第二。在FW中，兒茶素含量最高，熊果苷次之，3，4-二羥基苯丙氨酸含量排第三。在3種梨酒中，其余酚類物質含量均較少，不足 5 μg/mL，咖啡酸含量甚至不足 0.5 μg/mL。

表2 不同部位“雪花”梨榨取果汁所釀梨酒的酚類物質比較Table 2 Comparison of phenolics in different wine brewed by juice from differetn parts of'Xuehua'Pear

梨汁釀造成梨酒后，各單體酚的含量發生了變化。熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸和蘆丁含量在不同梨酒中均呈不同程度的下降趨勢，其中綠原酸減少幅度最大，為83.5%～98.3%；蘆丁次之，減少77%～80%，原兒茶酸減少50%～70%，熊果苷和沒食子酸減少幅度相近，為13%～43%。而3，4-二羥基苯丙氨酸、兒茶素含量則顯著增加，分別是梨汁的2.60倍（PFW）、5.28倍（FW）和7.16倍（WFW）。槲皮素含量在WFW和PFW中小幅增加了1%左右，在FW中增加18.0%。表兒茶素含量呈現不同的變化趨勢，PFW和FW分別是對應果汁的3.43倍和2.77倍，而在WFW中則略有減少（表2）。

2.2 梨酒的抗氧化性能分析

采用對DPPH自由基清除法測定比較了3種梨酒的抗氧化性能見圖1。

DPPH自由基清除率與酚類物質含量變化趨勢一致，WFW的DPPH自由基清除率最高，FW次之，PFW的清除率最低。通過相關分析得知，兩者的相關系數為0.746（p＜0.05）。通過對3種主要酚類物質含量和DPPH自由基清除率之間做相關分析，相關系數為0.678（p＜0.05），可知含量較低的其他酚類物質對清除DPPH自由基同樣發揮著作用。

圖1 “雪花”梨不同部位所釀梨酒對DPPH自由基清除能力比較Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability by different pear wine brewed using different part of'Xuehua'pear

對DPPH自由基清除率和各種單體酚含量進行偏最小二乘分析得知，任何一種酚類物質對DPPH自由基清除率均沒有顯著影響。說明清除DPPH自由基是各種酚類物質協同作用的結果。

3 討論和結論

WFJ酚類含量高于PFJ（表1），其含量的差異主要來源于果心，果心是酚類物質的重要來源[14]。而FJ酚類特別是綠原酸含量高于PFJ，與已有的文獻報道果肉的酚含量較低不同[14，19]，可能與提取方法有關。文獻報道是基于分析為目的的，多采用乙醇或甲醇提取，而本研究的材料是鮮榨果汁，沒有添加任何溶劑。鞠志國等[20]報道酚類物質存在于液泡中，因此果肉中的酚類物質相對于果皮、果心可能更容易隨果汁的榨取而溶出，而果皮、果心中的酚類物質不能在此方法中有效溶出所致。

熊果苷、綠原酸和蘆丁是梨的主要酚類物質，并且主要存在于果皮和果心中，在果肉中含量較低，與李麗梅等[14]在“雪花”梨的研究結果一致。所以WFJ和PFJ中熊果苷含量高于FJ（表1）。同時由于果肉中綠原酸含量相對熊果苷更高，故FJ中綠原酸含量高于WFJ和PFJ。在本研究中兒茶素的含量較低，可能與提取方法有關。

果汁釀制成梨酒后，酚類物質含量下降，與蘋果酒發酵過程中多酚含量的變化規律一致。多酚含量下降的原因是酵母菌細胞壁的吸附和多酚與細胞壁蛋白質的反應所致，同時在發酵過程中多酚物質也有部分的氧化[21]。

葡萄酒中含量較高的單體酚是兒茶素和沒食子酸，含量15 mg/L～30 mg/L[22]，而梨果實特別是梨皮和梨果心中則富含熊果苷和綠原酸、蘆丁，但綠原酸、蘆丁不穩定[23-24]，在發酵過程中可能被氧化或降解了，故梨酒中主要單體酚為熊果苷和發酵過程中可能由酵母代謝所產生的3，4-二羥基苯丙氨酸和兒茶素。可見果酒的酚類物質差異來源于原料和酵母代謝。熊果苷具有平喘、祛痰的作用[25]，或許賦予梨酒更多的生理功能，還有待于開展動物實驗進行驗證。在發酵過程中，單體酚含量發生復雜變化，有可能涉及到相互轉化，關于酚類物質變化的原因以及相互轉換機理還有待于進一步的研究。

已有的文獻報道清除DPPH自由基與總酚含量呈顯著正相關[26-28]，在本研究中兩者的相關系數為0.746（p＜0.05）。但偏最小二乘分析結果顯示，單個酚均對清除DPPH自由基無顯著影響，推測清除DPPH自由基是各種酚類物質協同作用的結果。具體的機理還需要進行深入的研究。

通過本研究得出結論：

1）果汁釀制成梨酒后，總酚含量下降。其中熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸和蘆丁含量在不同梨酒中均呈下降趨勢，其中綠原酸減少幅度最大；3，4-二羥基苯丙氨酸、兒茶素含量則顯著增加；槲皮素增幅較小，而表兒茶素含量則在3種梨酒中呈現不同的變化趨勢。

2）熊果苷、兒茶素和3，4-二羥基苯丙氨酸是3種梨酒中含量最高的3種酚，其余酚類物質含量均較少，不足5 μg/mL，咖啡酸含量甚至不足0.5 μg/mL。

3）DPPH自由基清除率與酚類物質含量呈正相關，但偏最小二乘分析結果顯示，任何一種酚類物質對DPPH自由基清除率均沒有顯著影響。說明清除DPPH自由基是各種酚類物質協同作用的結果。