分子量、脫乙酰度與濃度對(duì)殼聚糖流變性影響

莊晨俊，鐘宇

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

殼聚糖是幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰作用后的產(chǎn)物，而幾丁質(zhì)主要可從蝦、蟹等甲殼類動(dòng)物外骨骼以及某些低等動(dòng)植物（如藻類、真菌）中提取得來(lái)[1-2]，來(lái)源非常廣泛。殼聚糖作為自然界中唯一一種天然堿性多糖，具有游離的堿性氨基，這賦予它很多獨(dú)有的生物、生理特性，因此在食品、化工、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[3]，并且已于2014年作為增稠劑、被膜劑列入國(guó)家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中[4]。由于殼聚糖具有良好的抗菌作用[5]，成膜機(jī)械強(qiáng)度高，阻隔性能好，是非常理想的天然涂膜原料[6]，已廣泛應(yīng)用于食品保鮮上[7-8]。

殼聚糖成膜效果與膜液的流動(dòng)和形變密切相關(guān)，因此研究膜液的流變行為對(duì)殼聚糖膜品質(zhì)控制具有重要意義。多項(xiàng)研究[9-11]表明殼聚糖的固有性質(zhì)如分子量（molecular weight，MW）和脫乙酰度（degree of deacetylation，DD），及環(huán)境因素如溫度、pH值、溶液保存時(shí)長(zhǎng)等均會(huì)一定程度上影響所得溶液的流變性能。李星科等[9]指出殼聚糖溶液是剪切變稀的假塑性流體，黏度隨分子量與溶液濃度的增大逐漸增加；隨著脫乙酰度和pH值的增大，殼聚糖溶液的黏度先減小后增大，分別在脫乙酰度70.8%和pH 4.9時(shí)黏度達(dá)到最小。

然而，本文在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)殼聚糖溶液在低濃度下呈現(xiàn)脹塑性流體特性，其流變行為并非為固定的假塑性特性，且脹塑性與假塑性特性在食品最終成膜產(chǎn)生重大影響[12]，故本文著重考察殼聚糖分子量、脫乙酰度及濃度對(duì)成膜溶液流變性能的影響，深入研究殼聚糖溶液在不同濃度梯度下流變特性的變化情況，為殼聚糖涂膜在食品工業(yè)中應(yīng)用提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖粉末（脫乙酰度80.8%，分子量分別為5、19、61 kDa，三者代號(hào)分別為 1，2，3；分子量為 4.5 kDa，脫乙酰度分別為81.0%、88.1%、95.2%，三者代號(hào)分別為4，5，6）：山東奧康生物科技有限公司。

吐溫80（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙三醇、無(wú)水乙酸（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)：梅特勒-托利多公司，瑞士；R/S PLUS流變儀：Brookfield公司，美國(guó)；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ETS-D5磁力攪拌器：IKA集團(tuán)，德國(guó)；Heal Force Rop超純水機(jī)：力新儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖溶液制備

將定量殼聚糖溶于5 g/L的100 mL乙酸溶液中，添加30%（體積分?jǐn)?shù)）殼聚糖干重的甘油和5%（體積分?jǐn)?shù)）殼聚糖干重的吐溫80，常溫25℃下攪拌30 min至完全溶解，制成不同濃度（濃度梯度范圍在1.0%～3.3%）的殼聚糖樣品。根據(jù)zhuang等[13]試驗(yàn)方法，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5后，將溶液于-0.1 MPa下抽真空1 h去除氣泡，備用。

1.3.2 流變性能測(cè)定

將10 mL殼聚糖溶液緩緩倒入R/S PLUS流變儀盛具中，采用CC25轉(zhuǎn)子剪切溶液測(cè)定溶液表觀黏度隨剪切速率的變化。測(cè)試條件：25℃下，剪切速率在5 min內(nèi)從 0～300 s-1遞增，再于 5 min 從 300 s-1～0 遞減[13]。

剪切速率遞增經(jīng)歷的流變曲線被稱為上行線（uplink，UL），而遞減過(guò)程經(jīng)歷的流變曲線為下行線（downlink，DL），這樣一個(gè)完整循環(huán)稱滯后回路或滯后環(huán)，其圍合面積為滯后面積。

對(duì)非時(shí)間依賴性的假塑性和脹塑性流體，剪切應(yīng)力和剪切速率的關(guān)系可用牛頓冪律關(guān)系模型解釋：τ=Kγn。式中：τ為剪切應(yīng)力，Pa；γ 為剪切速率，s-1；K 為稠度系數(shù)；n為非牛頓指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖溶液流變特性測(cè)定

觸變性是指流體受剪切力作用，稠度發(fā)生變化，而在停止剪切后稠度又回復(fù)的一種可逆現(xiàn)象[14]，其強(qiáng)弱可以用滯后面積大小來(lái)表示[15]。滯后面積愈大，流體觸變性愈強(qiáng)，回復(fù)能力則愈差[16]。研究表明[17]，高分子溶液在濃度很低時(shí)，由于分子之間相距很遠(yuǎn)，導(dǎo)致各個(gè)分子鏈彼此獨(dú)立，即使在較快的剪切速率下，分子結(jié)構(gòu)回復(fù)速度仍然很快，下行線處于上行線上方；而濃度大時(shí)，分子鏈間相距緊密，受到剪切應(yīng)力后結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞且回復(fù)緩慢，出現(xiàn)滯后性，上行線處于下行線上方。

濃度2%，分子量5 kDa，脫乙酰度80.8%的殼聚糖溶液黏度隨剪切速率變化的上下行線與滯后回路如圖1所示。

圖1 1-2%殼聚糖溶液流變性能Fig.1 Rheological properties of chitosan film-forming solution of 1-2%

從圖1中可見(jiàn)，殼聚糖溶液為封閉型滯后回路，在0～300 s-1剪切速率下形成順時(shí)針?lè)较虻臏蠡芈罚闲芯€處在下行線上方，但滯后面積極小，說(shuō)明其回復(fù)能力良好，受到剪切作用后，內(nèi)部結(jié)構(gòu)依舊能在外力撤去后短時(shí)間內(nèi)回復(fù)。故后續(xù)試驗(yàn)僅討論上行線圖。

2.2 不同分子量對(duì)殼聚糖溶液流變性能的影響

為考察分子量影響，殼聚糖溶液濃度定為1.5%，不同分子量殼聚糖溶液流變性能見(jiàn)圖2。從圖2a中可以看出，隨著分子量增大，殼聚糖黏度線性提升，該結(jié)果與王偉等[18]的結(jié)果相一致。殼聚糖在水溶液中分子鏈充分伸展，會(huì)產(chǎn)生特殊的相互作用力，如分子間氫鍵等。分子量大的殼聚糖代表其聚合度較高，分子鏈較長(zhǎng)，在溶液中的相互纏結(jié)能力、聚集能力都極大提升，在溶液中引起的氫鍵與疏水相互作用增大，故可得到更大的黏度[5]。

圖2 不同分子量殼聚糖溶液流變性能Fig.2 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different MW

隨剪切速率的增加，19、61 kDa的殼聚糖溶液黏度發(fā)生了下降，屬于假塑性流體，與多項(xiàng)研究[9-11]結(jié)果相符合。其中，吳國(guó)杰等[11]認(rèn)為殼聚糖大分子鏈?zhǔn)艿郊羟辛ψ饔靡l(fā)了觸變效應(yīng)與局部取向，在與取向垂直的方向上，分子鏈上分子間作用力主要是范德華力，呈現(xiàn)各向異性從而引起了假塑性現(xiàn)象；本研究中，分子量為5 kDa的殼聚糖黏度卻隨剪切速率增加而上升，屬于脹塑性流體，其原因可能歸因于此時(shí)殼聚糖分子內(nèi)作用力小，而分子間發(fā)生纏結(jié)作用的幾率也小，當(dāng)發(fā)生剪切作用時(shí)，分子的流動(dòng)性反而使得多個(gè)分子間出現(xiàn)吸引纏結(jié)等作用，發(fā)生剪切變稠的現(xiàn)象。

以上行線剪切速率與對(duì)應(yīng)剪切應(yīng)力值的自然對(duì)數(shù)取商值作得擬合直線，如圖2b所示，該直線的斜率即為非牛頓指數(shù)n，用以表征溶液偏離牛頓流體的程度，n＜1，則表示該溶液為假塑性流體；n=1時(shí)為牛頓流體；而n＞1則是脹塑性流體，且n值越大，則隨剪切速率增加流體表觀黏度上升的幅度越大。從圖2b中可看出，隨分子量增大，n值分別為1.573 0、0.909 9、0.692 2。說(shuō)明殼聚糖溶液由剪切變稠轉(zhuǎn)為剪切變稀且稀化程度增大。另外，分子量越大，K值從0.001 8上升到2.460 1，增稠能力增強(qiáng)。

2.3 不同脫乙酰度對(duì)殼聚糖溶液流變性能的影響

不同脫乙酰度殼聚糖溶液流變性能見(jiàn)圖3，溶液濃度定為3.0%。殼聚糖分子鏈?zhǔn)怯梢阴０被咸烟桥c氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)單元所組成的，氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)單元所占的比例即殼聚糖的脫乙酰度。圖3a顯示的是分子量為4.5 kDa但脫乙酰度不同的殼聚糖溶液流變特性曲線。由圖3a可見(jiàn)，殼聚糖黏度均呈現(xiàn)隨剪切速率增加先增大（剪切速率在0～45 s-1范圍）后減小（45～300 s-1范圍）的趨勢(shì)，Benchabane A等[19]對(duì)羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose，CMC）溶液流變性能進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，CMC溶液的濃度在1.5%～5.0%時(shí)，經(jīng)較低速率剪切（小于10 s-1）表現(xiàn)為脹塑性流體特性。這可能是因?yàn)楦叻肿尤芤涸谳^高濃度下，分子鏈結(jié)構(gòu)較為緊密，分子間作用力較大，當(dāng)剪切速率很小時(shí)，分子鏈構(gòu)象變化緩慢，大分子鏈偏向于動(dòng)態(tài)平衡構(gòu)象，有足夠時(shí)間松弛回復(fù)，分子鏈間作用的機(jī)會(huì)在動(dòng)態(tài)平衡下大大增加，加強(qiáng)了分子間作用力；而隨剪切速率增大，剪切應(yīng)力破壞了這一平衡狀態(tài)，分子鏈重新回歸散亂狀態(tài)，出現(xiàn)大量的纏結(jié)與聚集現(xiàn)象，經(jīng)取向的分子鏈之間相對(duì)流動(dòng)阻力下降，導(dǎo)致表觀黏度減小，表現(xiàn)出假塑性流體特性。

圖3 不同脫乙酰度殼聚糖溶液流變性能Fig.3 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different DD

在0～300 s-1剪切速率范圍內(nèi)，脫乙酰度為88.1%的殼聚糖黏度均為最小，而脫乙酰度為81.0%和95.2%的殼聚糖溶液黏度較為接近。李星科等[9]研究表明，在分子量為326 kDa，脫乙酰度為60.5%～86.1%范圍時(shí)，溶液黏度在86.1%時(shí)得到最大值，約14.5 MPa·s。脫乙酰度的大小主要通過(guò)影響殼聚糖分子鏈的結(jié)構(gòu)、電荷密度從而影響分子鏈間的相互作用，Lamarque G等[20]研究得到脫乙酰度大于75%時(shí)，殼聚糖分子鏈具有柔順的構(gòu)象。而乙酰基本身空間位阻較大、疏水性強(qiáng)[21]，脫乙酰度下降會(huì)引發(fā)分子鏈剛性的增加與疏水作用的增強(qiáng)，因此脫乙酰度為81.0%的殼聚糖黏度較大。而脫乙酰度達(dá)到95.2%時(shí)，氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)單元占比更高，產(chǎn)生更強(qiáng)的分子間與分子內(nèi)氫鍵，也使得殼聚糖黏度有所提升。

圖3b顯示的是剪切速率與對(duì)應(yīng)剪切應(yīng)力自然對(duì)數(shù)的比值擬合曲線。由圖3b可知，隨脫乙酰度增大，n值相對(duì)接近，最大值在脫乙酰度為95.2%時(shí)得到，為1.023 6，稠度系數(shù)K值則在88.1%脫乙酰度時(shí)最小，為0.335 8。本試驗(yàn)中，脫乙酰度81.0%的殼聚糖溶液呈現(xiàn)假塑性流體性質(zhì)，而脫乙酰度95.2%的殼聚糖溶液傾向于脹塑性流體特性。可見(jiàn)，脫乙酰度變化會(huì)改變殼聚糖流體的流變特性。

2.4 不同濃度對(duì)殼聚糖溶液流變性能的影響

圖4a、圖4b分別顯示的是殼聚糖分子量4.5 kDa，脫乙酰度95.2%時(shí)，不同濃度下殼聚糖溶液的流變特性和lnτ/lnγ擬合曲線。

由圖4a可知，殼聚糖濃度的上升會(huì)使溶液黏度呈指數(shù)級(jí)提升，可能的原因是濃度增加會(huì)引起溶液中殼聚糖分子鏈的纏繞和聚集效果增加，鏈與鏈之間相互作用增強(qiáng)。李永鵬等[22]通過(guò)對(duì)不同濃度下殼聚糖凝膠的應(yīng)變掃描研究發(fā)現(xiàn)1.5%（m/V）的殼聚糖凝膠損耗模量與儲(chǔ)能模量很小，而2.0%（m/V）的殼聚糖凝膠模量則有了顯著提升，說(shuō)明高濃度下分子鏈由于密集程度上升，其相互之間的交聯(lián)和纏結(jié)幾率繼而提高，分子間作用力顯著增強(qiáng)。

不同濃度下殼聚糖溶液的非牛頓指數(shù)n、稠度系數(shù)K與300 s-1剪切速率下的黏度值見(jiàn)表1。由表1可知，溶液濃度在3.0%及以下時(shí)非牛頓指數(shù)n＞1，呈現(xiàn)脹塑性行為，且非牛頓指數(shù)隨濃度增加而下降，表明假塑性提高；而溶液達(dá)到3.3%時(shí)，溶液非牛頓指數(shù)小于1，呈現(xiàn)假塑性行為。溶液稠度系數(shù)隨濃度增加而增大，系數(shù)值在1.8%～2.1%及2.7%～3.3%范圍內(nèi)變化較大，表明該區(qū)間殼聚糖分子鏈構(gòu)象變化更為明顯。本試驗(yàn)中，溶液濃度提升不到1倍（1.8%～3.3%），但溶液黏度提高3.7倍以上（0.0954～0.4491）。

圖4 不同濃度殼聚糖溶液流變性能Fig.4 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different concentration

表1 不同濃度殼聚糖溶液非牛頓指數(shù)Table 1 Non-Newtonian index of chitosan film-forming solution with different concentration

2.5 殼聚糖溶液流變特性改變關(guān)鍵濃度

前述研究表明，在不同溶液濃度、分子量與脫乙酰度時(shí)，殼聚糖溶液均呈現(xiàn)了不同的流變屬性，在高分子量、高濃度下，殼聚糖溶液由假塑性流體轉(zhuǎn)變?yōu)槊浰苄粤黧w。究其原因，在低流速或者靜止?fàn)顟B(tài)下，由于殼聚糖分子在溶液中處于卷曲無(wú)規(guī)則狀態(tài)，且分子內(nèi)存在氫鍵與疏水作用，分子鏈又有相互纏結(jié)作用，導(dǎo)致較大的黏度。受到剪切應(yīng)力時(shí)，之前散亂分子之間的相互作用力被打破，大分子鏈沿著剪切方向取向，分子鏈運(yùn)動(dòng)阻力降低，產(chǎn)生剪切稀化的現(xiàn)象[23]。但在分子量較小或濃度過(guò)低的情況下，發(fā)生剪切作用時(shí)，分子的流動(dòng)性反而使得多個(gè)分子間出現(xiàn)吸引纏結(jié)等作用的幾率增大，形成更為牢固的結(jié)構(gòu)，于是發(fā)生黏度增加的現(xiàn)象[24]。

為繼續(xù)研究殼聚糖流變特性出現(xiàn)的濃度轉(zhuǎn)折點(diǎn)，以濃度0.25%為梯度制備不同濃度、不同分子量的殼聚糖溶液（其中，3號(hào)殼聚糖分子量較高，提高0.1%的濃度流變性即發(fā)生了顯著變化），以濃度0.30%為梯度制備不同濃度、不同脫乙酰度的殼聚糖溶液，以得到殼聚糖溶液從脹塑性流體轉(zhuǎn)變?yōu)榧偎苄粤黧w的濃度與最大剪切速率300 s-1下的黏度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 殼聚糖溶液黏度轉(zhuǎn)變非牛頓指數(shù)Table 2 Viscosity-transforming non-Newtonian index of chitosan film-forming solution

由表2可知，對(duì)于分子量較小的1號(hào)殼聚糖（5kDa）與分子量為4.5 kDa的4、5、6號(hào)殼聚糖，流變特性轉(zhuǎn)變所需濃度明顯大于大分子量殼聚糖（19、61 kDa），約為2倍～3倍；此時(shí)，最大剪切速率下的黏度也明顯增大。相對(duì)而言，脫乙酰度的變化對(duì)于流體性質(zhì)轉(zhuǎn)變所需濃度影響較小，但相應(yīng)稠度系數(shù)及黏度則隨脫乙酰度增加而提高。

3 結(jié)論

殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)特性對(duì)其流變特性具有顯著影響。殼聚糖溶液的表觀黏度隨分子量的增加而增大；而隨著脫乙酰度的增大，殼聚糖的黏度先減小后增大，在脫乙酰度88.1%時(shí)，溶液黏度達(dá)到最小值。殼聚糖溶液濃度增大，則分子鏈密集程度提高，黏度大大上升，對(duì)于分子量4.5 kDa、脫乙酰度95.2%的殼聚糖，濃度提高1.8倍，黏度可提高4.7倍。殼聚糖溶液在較低分子量情況下通過(guò)剪切應(yīng)力作用增加了分子鏈相互纏結(jié)的幾率，出現(xiàn)脹塑性流體特征，且轉(zhuǎn)變濃度與分子量呈負(fù)相關(guān)。