幾種因素優化對林木組織培養增殖培養影響探討

焦磊，史紹林

(1.黑龍江省林業監測規劃院，黑龍江 哈爾濱 150008；2.黑龍江省森林與環境科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

組培工廠化育苗是個系統工程[1]，繼代增殖技術是組培技術的核心，培養時間、增殖周期、增殖倍數、增殖系數、玻璃化等指標直接決定了組培產業化育苗的成本，是組培需優先解決的關鍵技術問題，尤其是試管苗繼代過程中的芽增殖率是一個重要經濟指標。雖然很多文獻都探討了如何建立初步的組織培養體系，但普遍增殖倍數較低，玻璃化率高、增殖周期長等條件限制了組培技術發展，不能滿足工廠化育苗的要求。筆者根據實踐經驗，探討了增殖培養過程中基本培養基的不斷優化，增殖周期的優化及玻璃化的控制對增殖優化的影響。

1 增殖基本培養基優化

增殖培養中培養基是植物組織培養最重要的部分[2]，在增殖組織培養過程中，不同植物或者不同類植物的培養基不一定相同，有時同種植物不同部分或者同個生長階段對培養基的營養要求也有所差異。經過科研人員不斷探索改進，現應用于植物組織培養中的培養基約幾十種。目前，培養基的配方基本上是以MS配方為基礎，加入一些活性物質改進的。培養基的成分主要包括無機鹽類的大量元素及微量元素和有機物質，碳源主要是蔗糖，有機養料一般用水解酪蛋白、氨基酸等。隨著培養基配方的逐步改良，加入了維生素和其他活性物質。試驗過程中，為調控變量，采用了較高純度的藥品和重蒸餾水。大量生產應用時，為降低成本可以用自來水代替重蒸餾水、普通蔗糖代替分析純蔗糖、采用馬鈴薯培養基等，同樣可以取得很好的效果。為了實現利用組織培養技術對文心蘭種苗工廠化生產，何松林[3]、谷風等[4]均開展了基本培養基增殖優化，通過對不同基本培養基對比，認為1/2MS的基本培養基對增殖最佳。葉秀仙等[5]通過正交試驗，篩選出適合于文心蘭 ‘小櫻桃’叢生芽增殖的基本培養基為改良1號，認為對特定基因型材料進行培養時，必須考慮材料的基因型，并且認為可能特定的基因型需要的大量元素不同。馬雪筠等[6]在篩選香蕉增殖培養的理想途徑培養過程中認為，在植物生長調節劑方面， 6-BA 3～5 mg·L-1具有較為理想的增殖率；而夏晶暉等[7]的試驗則指出，6-BA 0.5～1 mg·L-1是最好的分化增殖培養配方。刁桂萍在對歐美雜種優良無性系進行組培繁育技術的研究，發現能夠誘導歐美山楊雜種快繁的最適培養基是NT + BA 0.1 mg·L-1+ KT0.5 mg·L-1+2%蔗糖，同時利用再生試管苗的幼化特性，結合試管外生根技術、扦插技術，可以實現優良材料的大量繁殖，為歐美山楊雜種生產走上工廠化、產業化之路提供科學的技術依據[8]。楊林星用美國紅楓自由人槭‘秋焰’當年生枝莖段和休芽為外植體，得出其最佳消毒方式為0.1% HgCl2處理80 s，成活率可達80%，最適的增殖培養基為：改良MS培養基+IBA0.05 mg·L-1+ZT0.1 mg·L-1[9]。隨著數學、統計學在組織培養中的充分應用，為了達到不定芽增殖的極大值，正交設計、均勻設計、回歸設計、二次回歸正交旋轉試驗設計等方法被充分應用到增殖培養篩選培養基中[10，11]，力求達到組培工廠化育苗的要求。尤其是二次回歸正交旋轉試驗設計將回歸分析法與正交試驗法的優點有機地結合起來，在多種多因素、單因素試驗的基礎上，對試驗結果進行擬合，建立回歸模型，并對其進行模擬尋優，從中推導、篩選出最佳的措施和策略。

2 增殖周期的優化

增殖培養是組織培養的核心技術，是組織培養區別于扦插、嫁接、埋干等無性繁殖的最大優越性的體現。增殖培養過程中，不同濃度的細胞分裂素與生長素不斷的刺激外植體，使得不定芽等在離體條件下長期使用植物激素，生長點分生組織一直處于不斷分化的活躍狀態，隨著繼代次數的增加，研究人員一方面擔心實驗材料是否會保持原來的再生能力和增殖率[12]；另一方面也有研究表明隨著繼代次數的增多和時間的延長，染色體有可能會發生變異，導致增殖潛力降低[13]。蒲秀琴[14]等通過對百合組培苗數次繼代培養， 發現開始隨著繼代次數的增加，不定芽的增值率不斷提高，繼代培養三次時每個芽可增殖6個左右， 分化率較高， 同時組培苗的長勢最好， 之后隨著繼代次數的增加，分化率則逐漸下降。在木本植物中，隨著繼代次數的增加，增殖率不斷增加并穩定的研究較多，例如曹孜義在研究葡萄離體培養時發現，葡萄繼代增殖 48～80 代后增殖倍數并未降低[15]，師校欣等[16]研究發現蘋果離體培養100 余次，其器官再生能力沒有顯著變化。增殖周期的確定也是組培過程中的重要環節。周期過短，新芽形成的數量和質量會對下一步試驗造成影響；周期過長，不僅浪費增殖時間，還會對形成的新芽造成影響。筆者曾在自由人槭的研究中將自由人槭不定芽處理后接入培養基中，經觀察發現7 d后有新葉形成，14 d左右有新芽形成于莖段腋芽處，15 d左右新芽大量冒出，但長勢較弱，28 d后有效芽趨于穩定，到35 d后芽的生長趨勢開始下降，狹小的培養瓶和固定培養基已經不利于生長。為了提高增殖效率、縮短增殖時間，筆者認為28 d的增殖周期比較適宜。

3 增殖培養過程中玻璃化的控制

玻璃化是非受傷脅迫條件下試管苗的一種生理病變。隨著增殖培養時間、次數的增加，玻璃化現象是不可避免的。玻璃化發生時，葉片表面缺少蠟質和角質層，組織畸形，很難恢復到原來的狀態。自從玻璃化的概念提出后，玻璃化現象已經至少在3種木本植物中發生，玻璃化帶來的問題也越來越受到人們重視。關于玻璃化的控制和發生機理一直有各種假設和證實。玻璃化的本質是維管束木質化低，細胞含水量高。因此在組培工廠化生產中主要從降低含水量的方向入手。研究者在研究甜柿的組培體系時發現，水分狀況不佳是玻璃化的根本原因，將瓊脂濃度提高到10 g·L-1可降低培養基的水勢，能有效地防止玻璃苗的發生[17]。當三角瓶和培養皿中空氣不流通，氧氣不足的時候，也可能會因水量較高導致玻璃化。科學工作者為了解決培養瓶內水量較高的問題，還采用在制作完培養基之后，放置一段時間，讓水分充分蒸發。同樣的道理，也有人用透氣性好的牛皮紙或者棉塞封口，但這有可能會增加勞動強度，增加不必要的工作量，從而增加成本。此外減少培養瓶內接種數量，適當增加光照，或者增加某些陽離子的濃度，都可降低水勢，從而在一定程度上減少玻璃化的發生。