基于標準菌株Vd076的棉花黃萎病抗性快速分子評價方法初報

趙麗紅，馮自力，馮鴻杰，師勇強，周京龍，張冉，魏鋒，朱荷琴

（國家棉花生物學重點實驗室/ 中國農業科學院棉花研究所，河南安陽455000）

黃萎病（Verticillium wilt）嚴重影響棉花產量和品質，是比較難防治的維管束病害[1-2]。 該病發病時間長，化學防治和生物防治難度大[3-4]。目前，種植抗病品種是控制其危害的最經濟有效的措施[5-6]。

棉花品種抗黃萎病性鑒定方法分為成株期鑒定和苗期鑒定法。 由于棉花黃萎病是成株期病害，發生危害期為棉花的現蕾初期到收獲期，且不同品種對黃萎病的抗性與生育期相關，采用成株期鑒定更能真實檢測棉花品種的抗黃萎病性。 目前，成株期鑒定一般采用重病田或人工病圃，重病田鑒定由于不能控制病原菌的數量、 發病不均勻等問題，只能用于育種材料的初篩，而人工病圃成株期鑒定是確定棉花黃萎病抗性的最可靠方法，并于2009年發布實施了國家標準GB/T 22101.5—2009。苗期鑒定主要是通過菌液澆根[7]、蘸根[8]、針刺[9]等方法接菌，與成株期鑒定相比，大大縮短了鑒定周期，且比較容易掌握、 重復性也較好，但也存在以下不足：（1）反映的是苗期的抗病性，且人為傷根，很難達到對品種抗病性綜合評價的目的；（2） 需要嚴格的環境條件，且技術環節不易掌握，如：控制適宜的溫濕度、抗病和感病對照、接種時期、接種濃度和接種量、調查時期等；（3）耗費人力和物力，鑒定周期偏長，如：需要對土壤或基質進行滅菌、制作營養缽、培養病原菌等，仍需40 d 左右的鑒定周期。 鑒于棉花黃萎病發病周期長，在成株期和苗期鑒定棉花黃萎病抗性耗時較長，受環境影響大，為了滿足研究者的不同需求，有必要摸索棉花黃萎病抗性快速鑒定的新方法。 通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR） 技術鑒定植物抗病性已有諸多應用，如苜蓿[10]、甘蔗宿根矮化病菌[11]、普通菜豆[12]等，很多研究結果已經證明實時熒光定量PCR 技術能夠有效地區分抗病性水平不同的寄主植物，并不用單純通過植株外部病癥嚴重程度進行評價[13-15]。因此，本研究采用實時熒光定量PCR 技術檢測大麗輪枝菌 （Vd076） 在棉苗根部DNA的含量，然后分析其與寄主抗黃萎病性的關系，旨在建立一種更加快速的棉花黃萎病抗性鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 供試棉花品種

選取28 個黃萎病抗性不同的陸地棉品種，分別為冀棉11、創0712、冀棉169、中棉所49、新植5號、中植棉2 號、新陸早41 號、新陸中47 號、魯棉研28、中棉所50、冀棉958、瑞雜816、中棉所41、魯棉研21、中棉所63、銀瑞361、銀科178、嘉興5388、周棉9408、百棉1 號、H559、中棉所8 號、中棉所35、新陸早42 號、鄂雜棉29、湘雜棉7 號、新陸早7 號、銅雜411 F1。 其中，中植棉2 號為抗病對照，冀棉11 為感病對照。 供試品種均由本實驗室保存。

1.2 供試菌株

供試菌株為人工病圃棉花黃萎病抗性評價采用的標準菌株Vd076（CGMCC No.5902）[16]，由本實驗室保存。 于2007年分離自河南省內黃縣棉花黃萎病重病田，為致病力中等偏強、落葉型菌株。野生菌株經單孢純化后，于—80 ℃冰箱中保存。 將保存菌株于PDA 平板上活化，25～28 ℃培養6～7 d備用。

1.3 供試品種的抗病性鑒定

采用成株期人工病圃法[16]。2015年4月將供試棉花品種及對照品種播種于本所黃萎病人工病圃，每品種4 次重復，每重復2 行，行長5 m，行距0.8 m，每行留苗20 株，隨機排列，生長期間正常防治蟲害，不使用任何殺菌劑，栽培管理按日常大田管理進行。 依據國家標準（GB/T 22101.5—2009）中所述的五級分類法評判發病級別，根據調查結果，計算出發病率、病情指數和相對病情指數（IR）。 以相對病情指數來劃分各品種的抗病類型[17-18]。

1.4 實時定量PCR 快速鑒定方法的建立

1.4.1接菌方法。將各品種播種于滅菌的基質（蛭石與沙土體積比為6∶4）中，待2 片子葉長成時小心移栽到裝有棉花霍格蘭營養液[19]的長、寬、高分別為29.5 cm、18.5 cm、10 cm 的水培盆中，待1 片真葉平展時采用蘸根法接菌[20]。 將水培苗取出，放在裝有孢子懸浮液（含量為1×107mL—1）的大燒杯內浸泡40 min，保證所有根系均在液面以下，將接完菌的棉苗重新放入植物營養液中，繼續培養。

1.4.2取樣方法。培養1、2、3、4、5、6、7 d 時分別取出棉苗，先后用流動的自來水將根沖洗干凈，再用滅菌蒸餾水沖洗1 遍，用吸水紙充分吸干水分后剪成小段，再用錫箔紙包裹，經液氮速凍后，放入—80 ℃冰箱中用于DNA的提取。

1.4.3DNA提取及PCR 反應體系。采用CTAB法[21]提取供試菌株根部黃萎病菌（Vd076，下同）的DNA。 以棉花黃萎病菌的持家基因β 微管蛋白基因為模板，設計高特異引物，Vdβt-F：AACAACAGTCCGATGGATAATTC，Vdβt-R：GTACCGGGCTCGAGATC[19]，不同棉花品種的根部黃萎病菌DNA的定量采用Bio-Rad iQ5 實時熒光定量PCR 儀進行。

實時熒光定量PCR 反應體系為：引物Vdβt-F/Vdβt-R （10 μmol·L—1） 各0.4 μL，2×Ultra SYBR Mixture（康為世紀生物科技有限公司，北京） 10.0 μL，ddH2O 8.8 μL，模板DNA0.4 μL；擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40 個循環；融解曲線的程序為95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s。

1.4.4標準曲線的制作。測定黃萎病菌株和棉花根部黃萎病菌DNA含量，稀釋成100 mg·L—1的母液，按照梯度稀釋的原則分別用滅菌去離子水，將DNA稀釋成102、101、100、10—1、10—2、10—3mg·L—1共6 個質量濃度[12]。 每個質量濃度DNA稀釋液取2 μL 作為模板，用實時定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR 擴增，每個濃度重復3 次，對照分別為滅菌去離子水和100 ng 棉花根部DNA。以Ct值為縱坐標，DNA樣品濃度的對數值為橫坐標作圖，繪制DNA標準曲線并計算回歸方程、 確定特異性檢測引物的靈敏度及優化PCR 反應的擴增效率。

1.4.5最佳取樣時間的確定。以冀棉11、中植棉2號、魯棉研21 為供試品種，接種黃萎病菌后的1、2、3、4、5、6 和7 d 取棉苗根部。每個處理3 次重復。檢測根部黃萎病菌的含量。

1.4.6實時定量PCR 方法檢測供試棉花品種根部黃萎病菌DNA的含量。將28 個品種根部DNA樣品均制備成100 mg·L—1，取2 μL 為模板，通過實時熒光定量PCR 測定DNA樣品的Ct值，根據回歸方程的公式計算出100 ng 根部黃萎病菌DNA的含量，反應體系和程序同1.4.3。 為了保證樣品間的可比較性，28 個樣品在一次實時熒光定量PCR 反應中全部完成。

1.5 數據統計與分析

數據分析采用Statistix 8.1 數據分析軟件完成。 實時熒光定量qPCR （Real-time quantitative PCR detecting system，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統）數據采用iQ5 自帶軟件MyiQ2 Version 2.1（Bio-Rad Laboratories Co.，USA）生成擴增曲線、標準曲線和溶解曲線，回歸分析采用Microsoft Office Excel 2003 進行。 數據采用SPSS 17.0 軟件進行方差分析，采用最小顯著差異法進行差異顯著性檢驗（α＝0.05）。

2 結果與分析

2.1 供試棉花品種在病圃中的發病情況

2015年棉花黃萎病重病田的發病較為均勻，28 個品種呈現出不同的抗病性，發病率在20%～80%，相對病情指數分布在9.0～50.0。其中，表現為高抗的品種1 個，為創0712；表現為抗病的有中棉所49、冀棉958、新植5 號、冀棉169、銀瑞361、周棉9408、中植棉2 號共7 個；耐病品種有新陸早41號、魯棉研28、新陸中47、中棉所50、瑞雜816、中棉所41、 魯棉研21、 中棉所63、 銀科178、 嘉興5388、百棉1 號、H559、中棉所8 號、中棉所35 和銅雜411F1 共15 個；感病品種有冀棉11、新陸早7號、湘雜棉7 號、新陸早42 號和鄂雜棉29 共5 個（表1）。

2.2 標準曲線的繪制

以梯度稀釋的黃萎病菌DNA（102、101、100、10—1、10—2、10—3mg·L—1）為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，結果顯示Ct值（y1）與對數轉換（以2 為底）后的DNA質量濃度梯度（x1）呈現良好的線性關系，標準方程為：y1＝—3.081 4x1＋26.34，R2＝0.986 4，擴增效率為90.8%，線性范圍達到6 個數量級，Ct值范圍為19.73～34.58，最低可檢測到10—3mg·L—1（圖1）。

同樣地，以梯度稀釋的棉花根部黃萎病菌DNA為模板，進行實時熒光定量PCR 擴增，結果顯示Ct值 （y2） 與對數轉換后的DNA濃度梯度（x2） 呈現良好的線性關系，標準方程為：y2＝—2.648 9x2＋25.834，R2＝0.973 8（圖1）。

表1 28 個棉花品種的發病率、相對病情指數、抗性類型與接種后1 d 根部黃萎病菌DNA含量對照表

2.3 最佳取樣時間的確定

在接菌后的不同時間，感病、耐病和抗病品種根部的黃萎病菌DNA含量呈現出一致的趨勢，均表現為感病品種冀棉11 的最高，其次是耐病品種魯棉研21，而中植棉2 號最低（圖2）。 差異顯著性分析表明，在接菌后1、4、5、6、7 d，抗病品種、耐病品種和感病品種之間根部黃萎病菌DNA含量均達差異顯著水平，在接菌后的1 d，感病品種冀棉11根部黃萎病菌DNA含量最高（3.0 mg·g—1），抗病品種中植棉2 號最低（0.83 mg·g—1），耐病品種魯棉研21 介于兩者之間（2.02 mg·g—1）。 為達到快速、準確的目的，確定接菌后1 d 為最佳取樣時間。

圖1 實時熒光定量PCR 標準曲線

圖2 3個品種接菌后不同時間的黃萎病菌DNA含量比較

圖3 接菌后1d不同品種棉花根部黃萎病菌DNA含量和相對病情指數對比

2.4 不同品種棉花根部黃萎病菌DNA的含量

接種1 d 后，在28 個棉花品種根部黃萎病菌DNA的含量為0.3～5.0 mg·g—1。 病圃鑒定中表現為高抗的品種創0712（病情指數為9.0）根部黃萎病菌DNA的含量最低，為0.3 mg·g—1；DNA含量最高的為感病對照品種冀棉11，達到5.0 mg·g—1，其病圃鑒定中病情指數也是最高（50.0）（圖3）。 相關性分析顯示，供試品種的病情指數與根部黃萎病菌DNA含量之間呈顯著正相關（圖4）。

2.5 依據根部黃萎病菌DNA含量評價棉花品種抗病性的標準

28個供試品種中表現為高抗的品種有1個，為創0712，其根部黃萎病菌DNA含量為0.3 mg·g—1；表現為抗病的有冀棉169、中植棉2 號、周棉9408、新植5 號、冀棉958、銀瑞361 和中棉所49共7 個，其根部黃萎病菌DNA含量為0.5～1.0 mg·g—1；表現耐病的品種有魯棉研28、百棉1 號、中棉所41、新陸中47 號、嘉興5388、銀科178、中棉所63、中棉所50、H559、魯棉研21、新陸早41 號、中棉所8 號、瑞雜816、中棉所35 和銅雜411 F1共15個，其根部黃萎病菌DNA含量為1.2～3.0 mg·g—1；表現感病的品種有新陸早42 號、鄂雜棉29、湘雜棉7 號、新陸早7 號和冀棉11 共5 個，其根部黃萎病菌DNA含量為3.1～5.0 mg·g—1（表1）。 因此，依據人工病圃鑒定結果和熒光定量PCR 的檢測結果，推薦基于棉花根部黃萎病菌熒光定量PCR 檢測結果評價棉花黃萎病抗性的分級標準：0～0.3 mg·g—1為高抗品種，0.3～1.0 mg·g—1為抗病品種，1.0～3.0 mg·g—1為耐病品種，＞3.0 mg·g—1的為感病品種。

圖4 供試棉花品種的病情指數與根部黃萎病菌DNA含量之間的相關性

3 結論與討論

鑒于棉花黃萎病發病周期長，在病圃和重病田鑒定棉花黃萎病抗性結果可靠，但是耗時較長，為了滿足研究者的不同需求，有必要摸索棉花抗病性快速鑒定的新方法。棉花根部是黃萎病菌侵入寄主的第一道屏障[22]，不同抗病性棉花品種的根系分泌物對黃萎病菌生殖生長和孢子萌發影響不同，前者起抑制作用，后者則呈現促進作用。 分析氨基酸和可溶性糖的組分，發現抗病品種根系分泌物中的種類較感病品種顯著降低[23-24]。 由于不同抗病性棉花品種根系分泌物的差異，或許會引起病原菌在根部定植量的差異。目前很多研究結果已經證明實時熒光定量PCR 技術能夠有效地區分抗病性不同的植物寄主[13-14]，優于單純通過植株外部病癥嚴重程度進行評價。

傳統的溫室培養，一般接種病原菌7 d 后棉花葉片才有輕微的典型黃萎病病斑出現[17]，但是不足以進行抗病性評價。 本研究通過熒光定量PCR 技術能夠在棉花品種表現出明顯發病癥狀前定量檢測寄主根組織內的黃萎病菌DNA含量，在水培棉苗接種后1 d 沒表現出任何發病癥狀時就可以有效區分不同抗病性的品種[25]。 這使得該技術克服了傳統抗病鑒定方法中耗時長、受環境影響大、準確性不高等缺陷。 但是，本研究建立的棉花黃萎病抗性快速評價方法僅是根據病圃鑒定標準菌株Vd076 的根部黃萎病菌DNA含量建立的，后續研究中研究者如果采用其他菌株，需要重新建立根部黃萎病菌DNA含量與品種抗病性之間的關系。

綜上，該研究為棉花資源材料、新品種（系）的快捷篩選提供了新思路，在抗病品種分子輔助選擇中有很好的應用前景。