染料木黃酮通過ERK及JNK通路抑制人非小細胞肺癌PC14細胞增殖

姜雪梅，錢越，戴紅良

（錦州醫科大學 1. 附屬第一醫院消化科； 2. 附屬第一醫院變態反應與臨床免疫研究中心； 3. 護理學院社區護理學教研室，遼寧 錦州 121001）

肺癌在我國發病率極高。據統計，我國每年約有52萬肺癌新發病例出現，死亡率為45萬/年。其中，超過80%的晚期肺癌屬于非小細胞肺癌［1］。盡管過去的20年間，人們對于肺癌有了更加充分的理解，但肺癌患者的5年生存率仍然很低［2］。染料木黃酮是大豆中重要的植物化學物，具有較強的酪氨酸激酶抑制活性［3-4］。近年來，染料木黃酮的抗癌作用備受關注。研究顯示，染料木黃酮可抑制結腸直腸癌［5］、肝癌［6］、乳腺癌［7］及口腔癌［3］等多種癌細胞的增殖。也有研究［8-9］顯示，染料木黃酮對肺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用。本研究擬觀察染料木黃酮對非小細胞肺癌PC14細胞增殖的影響，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

染料木黃酮 （純度99.1%，中國藥品生物制品檢定所），DMEM培養基和胎牛血清 （美國Thermo Fisher Scientific公司），二甲基亞砜、噻唑藍、結晶紫、PD98059、SB203580、SP600125 （美國Sigma公司），p-ERK抗體 （沈陽萬類生物科技有限公司），JNK，p-JNK和ERK抗體 （美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記二抗 （美國Santa Cruz公司），二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），倒置顯微鏡 （德國LEICA公司），潔凈工作臺 （青島海爾生物醫療股份有限公司），酶標儀 （美國Thermo Fisher Scientific公司），電泳儀及轉膜儀 （美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人非小細胞肺癌PC14細胞購自中國科學院上海細胞庫。細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下進行培養。0.25% EDTA胰酶消化傳代，待細胞處于對數生長期時進行實驗處理。

1.2.2 細胞增殖檢測：將對數生長期的PC14細胞接種于96孔板，培養過夜，每孔分別加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續培養24、48、72 h。藥物作用結束后，每孔加入5 g/L的MTT，繼續培養4 h，隨后以150 μL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波長處測定每孔吸光度值。

1.2.3 細胞集落形成實驗：將PC14細胞接種于6孔培養板中，每孔600個細胞，培養過夜后，每孔加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續培養10 d，隨后棄去培養液并用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定后結晶紫染色并拍照。

1.2.4 蛋白提取和免疫印跡：收集細胞，加入含0.1% PMSF的RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。蛋白經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至聚偏氟乙烯膜。以新鮮配置1% BSA室溫下封閉1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。用TBS-T充分洗去非特異結合的抗體后，室溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。TBS-T充分洗滌后，ECL顯色后經凝膠成像儀成像分析。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 染料木黃酮對PC14細胞增殖的影響

不同濃度染料木黃酮處理PC14細胞24、48和72 h后，細胞增殖隨著藥物濃度的增加和時間的延長，呈現出明顯的下降趨勢；集落形成實驗也顯示，染料木黃酮可劑量依賴性地抑制PC14細胞集落的形成，見表1，圖1。

2.2 MAPK抑制劑對PC14細胞增殖的影響

表1 染料木黃酮對PC14細胞生長的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

表1 染料木黃酮對PC14細胞生長的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

1） P < 0.05 vs control group at the same time point.

Optical density 24 h 48 h 72 h Control 0.21±0.02 0.36±0.03 0.47±0.02 Genistein 2.5 mg/L 0.22±0.03 0.36±0.02 0.46±0.05 Genistein 5 mg/L 0.22±0.01 0.37±0.02 0.33±0.051）Genistein 10 mg/L 0.20±0.02 0.35±0.03 0.21±0.041）Genistein 20 mg/L 0.22±0.03 0.26±0.031） 0.11±0.021）Group

ERK特異性阻斷劑PD98059、p38MAPK特異性阻斷劑SB203580及JNK特異性阻斷劑SP600125可使對照組MTT吸光度值由0.49分別下降至0.36、0.28及0.22。表明這3個MAPK分子在PC14細胞中均起到促進增殖的作用。

2.3 染料木黃酮對PC14細胞MAPK信號通路的影響

PC14細胞經不同濃度染料木黃酮處理后，p-p38MAPK蛋白的表達不受藥物影響，而p-ERK及p-JNK的水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，見圖2。

3 討論

圖1 染料木黃酮對PC14細胞增殖的影響Fig.1 Effects of genistein on PC14 cell proliferation

圖2 染料木黃酮對PC14細胞ERK及JNK通路的影響Fig.2 Effect of genistein on the ERK and JNK pathways in PC14 cells

近年來，天然物質高效低毒的特性受到藥物研究人員的廣泛關注。染料木黃酮是存在于大豆等植物中的天然異黃酮類非營養物質。研究［3-4］證實，該物質具有抑制平滑肌源性泡沫細胞的形成、抑制星形膠質細胞水腫及抗腫瘤等多種生物活性。研究［3］顯示，染料木黃酮對多種腫瘤細胞的生長均顯示出強大的抑制作用，而其對非小細胞肺癌作用和機制的研究尚處于初步階段。本研究證實，染料木黃酮能顯著抑制非小細胞肺癌PC14細胞的增殖，這與凌藝輝等［10］（H1299細胞） 及崔俊英等［11］（H1975） 報道的結果類似。同時，相較口腔癌TCA8113細胞，PC14細胞對染料木黃酮似乎更為敏感，2.5 mg/L的染料木黃酮即可顯著降低肺癌細胞增殖［3］。

MAPKs屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括ERK、JNK和p38MAPK 3個家族成員，在調節細胞增殖、分化、遷移、侵襲、炎癥、死亡等多種生物學過程中都起著極為重要的作用［12］。但隨著細胞類型、刺激條件、刺激時程等的不同，MAPKs家族既可以誘導細胞的增殖，又可能導致其死亡［12-13］。本研究發現，MAPKs特異性抑制劑可顯著抑制PC14細胞的增殖，表明MAPKs分子的活化對于PC14細胞的增殖是不可或缺的。與此同時，本研究還證實染料木黃酮可顯著抑制ERK及JNK的活化?；谏鲜鼋Y果，染料木黃酮對PC14細胞的增殖抑制活性與其對ERK及JNK的抑制有關。

肺癌在世界范圍內發病率和死亡率都很高，臨床上的治療手段目前主要有手術、放療和化療等，但目前的化療藥物一般不良反應都較大，且其療效有限［14-15］。因此，開發新型高效低毒的抗肺癌藥物仍然是擺在藥物工作者面前的一項重任。本研究證實，染料木黃酮可通過調控ERK和JNK的活化抑制肺癌細胞的增殖，染料木黃酮屬于天然活性化合物，與傳統化療藥物相比，其療效確切、來源廣泛、價格低廉、不良反應小，有望成為臨床上治療肺癌的新選擇。