結核分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細胞MALAT1的表達及其作用研究

黃舒穎，張 誠，黃自坤，羅 清，卿 城

(1.南昌大學第一附屬醫院婦產科，南昌 330006；2.江西衛生職業學院，南昌 330052； 3.南昌大學第一附屬醫院超聲科，南昌 330006；4南昌大學第一附屬醫院檢驗科，南昌 330006； 5.南昌大學第一附屬醫院重癥醫學科，南昌 330006)

結核感染嚴重威脅人類健康，是單一病原菌導致患者死亡最高的感染性疾病。世界衛生組織公布的報告顯示，全球每年約有700萬新發病例，死亡人數高達200萬人[1]。當前研究認為，結核病與機體免疫功能密切相關。結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染機體后主要寄生于巨噬細胞內，是典型的胞內致病菌。當機體免疫力強時，巨噬細胞免疫激活，可殺滅胞內寄生的MTB；而人體免疫低下時，MTB可抑制巨噬細胞活化，長期存活于巨噬細胞內[2]。當前的研究對MTB如何逃避免疫反應尚未完全掌握，相關研究對未來結核病防控具有重要意義。

長鏈非編碼RNA (long-noncoding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA分子，幾乎不具有蛋白編碼能力。研究證實lncRNA廣泛存在于哺乳動物體內，在轉錄剪切后可直接折疊成高級結構，以 RNA的形式與蛋白、DNA或者RNA結合，對目標靶分子進行轉錄和轉路后水平調控[3]。在免疫調控[4]、腫瘤生長[5]、細胞代謝[6]等多種生物學過程中發揮重要作用。lncRNA人類肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)最先是在肺部腫瘤中被發現，隨后證實其在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤疾病中發揮重要作用[7]。近年來研究證實MALAT1參與了機體炎癥免疫過程，是體內重要的免疫調節因子。ZHAO等[8]研究發現LPS刺激THP-1和RAW264.7巨噬細胞后，細胞內 MALAT1 表達升高，進一步研究發現，MALAT1是通過調控核因子-κB(NF-κB)炎癥信號通路調節炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)表達。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可調節高糖誘導的內皮細胞炎性反應。目前，有關MALAT1在RAW264.7巨噬細胞抗結核免疫中的作用鮮見報道。本研究擬通過MTB感染RAW264.7巨噬細胞，RT-qPCR檢測MALAT1、TNF-α mRNA表達，探討MALAT1在RAW264.7巨噬細胞抗結核免疫中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 MTB標準菌株H37Rv(ATCC 27294)在本實驗室保存；RAW264.7巨噬細胞(中科院上海細胞研究所)；DMSO、DMEM(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Trizol試劑、LipofectmineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司)；逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物TaKaRa公司)；siRNA干擾試劑(廣州銳博公司)。熒光定量PCR采用Applied Biosystems 7600系統(美國ABI公司)。其他所用試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞感染MTB模型的建立 將處于對數期生長的RAW264.7巨噬細胞加入24孔板培養(37 ℃、5%CO2)至細胞貼壁良好，H37Rv按照感染復數(multiplicity of infection,MOI)=5感染巨噬細胞，4 h后PBS清洗細胞并繼續培養，12 h后Trizol法提取細胞總RNA。

1.2.2RT-qPCR 在感染后的不同時間點(0、48 h)Trizol法分別提取細胞總RNA，具體實驗步驟按試劑說明書進行。RT-qPCR檢測細胞MALAT1、TNF-α mRNA表達情況，采用TaKaRa公司逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒進行實驗，具體的操作步驟、實驗條件設置按照試劑盒操作說明書進行。TNF-α[10]：上游引物5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3′，下游引物5′-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3′；MALAT1[8]:上游引物5′-CAT GGC GGA ATT GCT GGT A-3′，下游引物5′-CTG CCA ACA GCA TAG CAG TA -3′；內參基因GAPDH[8]:上游引物5′-TGG TGA AGC AGG CAT CTG AC-3′，下游引物5′- TGC TGT TGA AGT CGC AGG AG-3′。

1.2.3siRNA細胞轉染 制備MALAT1 siRNA及control siRNA(siNC)，具體由上海Gene Pharma公司完成。siRNA引物序列[8]：上游引物5′- GCG GAA GCU GAU CUC CAA UTT -3′，下游引物：5′- AUU GGA GAU CAG CUU CCG CTT -3′。巨噬細胞分為空白對照組、siMALAT1轉染組及siNC轉染組。培養的巨噬細胞貼壁良好后，將siMALAT1或siNC轉染，根據LipofectamineTM2000轉染操作說明書進行操作，轉染4～6 h后更換完全培養基，24 h后收集細胞，Trizol提取細胞RNA，RT-qPCR檢測siRNA敲減效果。

1.2.4siMALAT1后TNF-α mRNA的表達 siMALAT1后的巨噬細胞與H37Rv按MOI=5的比例對細胞進行感染，48 h后RT-qPCR檢測細胞TNF-α mRNA表達。

1.2.5siMALAT1后MTB殺菌功能 siMALAT1后的巨噬細胞與H37Rv按MOI=5的比例進行感染，4 h后用PBS清洗細胞(H37Rv感染后0 h時間點)。分別于H37Rv感染后0、72 h收集并裂解各組巨噬細胞，將裂解液進行系列梯度稀釋后立即接種于含有 OADC的7H10固體培養基上，3～4周后進行MTB菌落計數。

2 結 果

2.1H37Rv感染巨噬細胞后MALAT1及TNF-α mRNA變化 RT-qPCR檢測顯示，感染后48 h細胞內MALAT1和TNF-α mRNA表達均上調(P<0.05)，見圖1。

圖1 H37Rv感染巨噬細胞后MALAT1和TNF-α mRNA表達情況

2.2MALAT1沉默后對巨噬細胞TNF-α mRNA表達影響 通過RNAi技術成功沉默巨噬細胞MALAT1表達，見圖2A。將該細胞感染H37Rv，沉默MALAT1后的巨噬細胞與siNC轉染組比較，TNF-α mRNA表達明顯增加(P<0.05)，見圖2B。

2.3MALAT1沉默對巨噬細胞抗H37Rv殺菌能力的影響 siMALAT1轉染組與siNC轉染組細胞荷菌量在0 h時差異無統計學意義(P>0.05)。在H37Rv感染72 h后，siMALAT1轉染組巨噬細胞內H37Rv的存活率明顯減少(P<0.05)，見圖3。

圖3 siMALAT1對巨噬細胞清除結核菌能力的影響

3 討 論

隨著微生物學、分子生物學、藥物化學及醫學其他學科的進步，人類在抗結核病治療方面取得了突破性的進展，但至今仍未實現徹底治愈該病的能力。近年來隨著HIV流行、多耐藥結核菌的產生，對當前的結核病治療提出了新的目標。

結核菌是一種胞內寄生微生物，作為結核菌主要宿主細胞的巨噬細胞在抗結核免疫過程中扮演重要角色。巨噬細胞可以直接吞噬和殺傷結核菌，同時也可提呈抗原以激發機體的體液及細胞免疫反應。結核菌可通過阻止巨噬細胞吞噬體和溶酶體融合，抑制巨噬細胞活化等多重方式對抗巨噬細胞的殺菌作用，從而實現了在胞內長期存活，躲避機體免疫清除的目的[11-12]。因此，巨噬細胞抗結核免疫過程在結核病的防控中具有重要的臨床及科研價值。

lncRNA曾經被認為是無用的轉錄分子，然而近年的研究徹底顛覆了人們以往的認知，即lncRNA是一類具有重要調控功能的細胞分子。在免疫系統領域，lncRNA在巨噬細胞[13]、淋巴細胞[14]、樹突狀細胞[15]等免疫細胞的功能調控方面發揮著重要的作用。已有部分研究顯示，lncRNA與巨噬細胞抗結核免疫反應有關，例如lncRNA CD244可調控結核感染過程中CD8+T細胞IFN-γ和TNF-α分泌[16]。巨噬細胞沉默lncRNA MEG3可增強其對BCG清除能力[13]。這些研究認為lncRNA在結核菌感染巨噬細胞后的細胞免疫反應中發揮重要作用。

本研究選取了跟炎癥免疫密切相關lncRNA分子MALAT1，它最早在非小細胞肺癌研究中被發現，之后的大量研究發現該分子與炎性反應密不可分。XU等[17]在對乳腺癌的研究中發現MALAT1可調控炎癥相關信號通路PI3K/Akt；ZHOU等[18]發現在口腔鱗癌中MALAT1可影響胞內炎癥通路NF-κB活化。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可調節高糖誘導的內皮細胞炎癥因子TNF-α表達。也有研究證實MALAT1與巨噬細胞NF-κB炎癥通路活化有關[8]。由于結核菌感染巨噬細胞后會誘發一系列炎性反應，筆者推測MALAT1可能參與了結核菌感染相關炎性反應過程，且當前尚未有MALAT1在H37Rv感染RAW264.7巨噬細胞后表達及作用的相關研究。

本研究結果表明，H37RV感染會上調MALAT1在巨噬細胞中表達；與此同時，細胞內炎癥因子TNF-α mRNA表達也上調。表明結核菌感染巨噬細胞后，細胞迅速活化，促炎因子表達上調，這是免疫細胞啟動免疫過程以殺傷結核菌的表現。鑒于MALAT1在炎性反應中的調控作用，本文構建了MALAT1沉默的巨噬細胞，之后再感染結核菌，結果發現，siMALAT1后可促進巨噬細胞TNF-α mRNA表達上調，即MALAT1表現出抑制炎性反應的作用。進一步細菌計數實驗發現，siMALAT1后可明顯增強RAW264.7巨噬細胞對結核菌的胞內清除能力，充分表明了MALAT1積極參與了巨噬細胞感染結核菌后的免疫反應過程。

綜上所述，本研究表明結核菌H37Rv感染RAW264.7巨噬細胞后可上調細胞內MALAT1和炎癥因子TNF-α mRNA，沉默MALAT1將增強巨噬細胞對結核菌的清除能力，為結核病免疫治療提供了新的靶點和思路。