白細胞介素-1受體拮抗蛋白對大鼠創傷性骨 關節炎的治療作用及機制研究

宋思琦,吳 丹,胡毓詩△

(1.成都體育學院運動醫學與健康學院,成都 610041;2.北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084)

創傷性骨關節炎(post-traumatic osteoarthritis，PTOA)是一種由于創傷引起的關節軟骨退化、增生、骨化的一種OA，臨床病癥主要變現為關節疼痛、關節活動障礙等[1-2]。近年來，由于交通事故、外傷的增多，PTOA的發生率呈現上升的趨勢[1-2]。目前學者對于PTOA的自然演變過程不甚了解，但由于創傷的作用，導致的關節軟骨的降解速度遠大于合成速度已成為PTOA的重要病理機制之一[2-4]。白細胞介素-1(IL-1)是一種常見的促炎因子，能夠通過特異性的結合于軟骨表面的IL-1受體，促進軟骨降解，并分解細胞外基質，是OA發生、發展過程中的中心環節[5-7]。白細胞介素-1受體拮抗蛋白(interleukin -1 receptor antagonist protein，IL1RA)是IL-1天然拮抗劑，能阻斷IL-1與其受體的結合，進而抑制IL-1α/β對軟骨的破壞。研究已經顯示IL1RA對OA具有治療作用[8]，但對于PTOA的治療作用報道較少，因此本研究將對此展開研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 50只體質量200～250 g的清潔級健康成年SD大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，均在(23±2)℃的室內溫度內自由飲食和攝水。

1.2主要試劑與儀器 細胞裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司；超敏發光液購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5、TIMP-1、TIMP-3及GAPDH多克隆抗體均購自美國Abcam公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司；IL-1β、IL-8及TNF-α ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學發光成像系統、CFX ConnectTM實時熒光PCR儀購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；UV-1600PC型紫外分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1PTOA大鼠模型的復制、分組及給藥 參考文獻[1,3]，采用前交叉韌帶切斷(ACLT)復制PTOA大鼠模型。將造模成功的大鼠分為模型組，IL1RA低、中、高劑量組(10、20、40 mg/mL)，另外將只打開關節腔的大鼠設立為假手術組，每組10只。造模成功后每天按分組情況進行大鼠關節腔注射，連續14 d。將大鼠處死，取關節軟骨置于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2ELISA檢測軟骨組織中IL-1β、IL-8及TNF-α水平 取適量軟骨組織，勻漿后加入細胞裂解液裂解，離心取上清液，按IL-1β、IL-8及TNF-α ELISA試劑盒說明書測定IL-1β、IL-8及TNF-α水平。

1.3.3Realtime PCR法檢測COL-Ⅱ、Aggrecan、MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA的表達 將適量軟骨組織勻漿后，加入Trizol裂解液，并采用Trizol法抽提總RNA。紫外分光光度計測定RNA純度，當OA260nm/OA280 nm比值在1.8～2.1，根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄RNA，最后根據Realtime PCR擴增試劑盒檢測RNA。擴增結果利用2-ΔΔCT法進行分析。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變形5 s，60 ℃退火25 s，45個循環。

1.3.4Western blot檢測軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5、TIMP-1及TIMP-3蛋白的表達 將適量軟骨組織勻漿后，加入細胞裂解液裂解組織，離心收獲上清液。測定上清液蛋白濃度，并定量。制作濃縮膠及分離膠，上樣，進行凝膠電泳，轉PVDF膜，2%BSA室溫封閉1 h，一抗(兔抗MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5、TIMP-1、TIMP-3及GAPDH多克隆抗體)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育，加入曝光液后，在凝膠成像系統中報告，并根據Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-8及TNF-α水平 與假手術組比較，模型組軟骨組織中IL-1β、IL-8及TNF-α水平明顯提高(P<0.01)；與模型組比較，IL1RA低、中、高劑量組軟骨組織中IL-1β、IL-8及TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-8及TNF-α水平

組別IL-1βIL-8TNF-α假手術組4.58±0.546.42±0.675.18±0.55模型組17.32±2.13?19.44±2.08?26.78±2.94?低劑量組13.20±1.42#15.37±1.78#20.04±2.00#中劑量組9.28±1.05#10.76±1.34#13.15±1.54#高劑量組5.93±0.72#7.24±0.73#7.41±0.75#

*:P<0.01,與假手術組比較；#:P<0.01,與模型組比較

2.2各組大鼠軟骨組織中COL-Ⅱ、Aggrecan mRNA的表達 與假手術組比較，模型組軟骨組織中COL-Ⅱ、Aggrecan mRNA表達明顯下調(P<0.01)；與模型組比較，IL1RA低、中、高劑量組軟骨組織中COL-Ⅱ、Aggrecan mRNA表達明顯上調(P<0.01)，見表2。

2.3各組大鼠軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA的表達 與假手術組比較，模型組軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA表達明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，IL1RA低、中、高劑量組軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA表達明顯下調(P<0.01)，見表3。

表2 各組大鼠軟骨組織中COL-Ⅱ、Aggrecan mRNA表達的變化

*:P<0.01,與假手術組比較；#:P<0.01,與模型組比較

表3 各組大鼠軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA表達情況

*:P<0.01,與假手術組比較；#:P<0.01,與模型組比較

表4 各組大鼠軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 蛋白表達情況

*:P<0.01,與假手術組比較；#:P<0.01,與模型組比較

2.4各組大鼠軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 蛋白的表達 與假手術組比較，模型組軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5蛋白表達明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，IL1RA低、中、高劑量組軟骨組織中ADAMTs-4、ADAMTs-5蛋白表達明顯下調(P<0.01)，IL1RA中、高劑量組軟骨組織中MMP-1、MMP-13蛋白表達明顯下調(P<0.01)，見圖1、表4。

A：假手術組；B：模型組；C：IL1RA低劑量組；D：IL1RA中劑量組；E：IL1RA高劑量組

圖1各組大鼠軟骨組織中MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5蛋白表達的變化

A：假手術組；B：模型組；C：IL1RA低劑量組；D：IL1RA中劑量組；E：IL1RA高劑量組

圖2 各組大鼠軟骨組織中TIMP-1、TIMP-3蛋白表達情況

*:P<0.01,與假手術組比較；#:P<0.01,與模型組比較

2.5各組大鼠軟骨組織中TIMP-1、TIMP-3蛋白表達情況 與假手術組比較，模型組軟骨組織中TIMP-1、TIMP-3蛋白表達明顯下調(P<0.01)；與模型組比較，IL1RA低、中、高劑量組軟骨組織中TIMP-1、TIMP-3蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖2、表5。

3 討 論

IL1RA作為IL-1的天然拮抗劑，能夠特異性的結合于軟骨表面的IL-1受體，進而抑制IL-1α/β對軟骨的破壞作用[8]。研究顯示在大鼠關節軟骨急性損傷期關節腔注射IL1RA，能明顯上調miR-27b、miR-140、miR-125b進而抑制軟骨的分解[9]。而且IL1RA能明顯降低ACLT復制的PTOA大鼠的軟骨及滑膜評分，同時抑制軟骨細胞凋亡[10]。進而提示IL1RA對PTOA大鼠具有一定治療作用，但具體的作用機制不甚了解。本研究首先通過ACLT構建PTOA大鼠模型，進而檢測不同劑量的IL1RA對PTOA大鼠關節軟骨中炎癥因子水平的影響，結果表明IL1RA能明顯降低IL-1β、IL-8及TNF-α水平，IL-1β、IL-8及TNF-α主要是由活化的單核-巨噬細胞分泌產生的促炎因子，其中TNF-α不僅能夠破壞軟骨，還可以促進IL-1β、IL-8的分泌進而加重軟骨的損傷，而且IL-1β、IL-8及TNF-α能夠刺激細胞外基質降解酶的分泌加速細胞外基質的降解，進而加重軟骨損傷。研究顯示人PTOA或動物模型PTOA中IL-1β、IL-8及TNF-α的水平均明顯提高[11-12]，因此本研究結果表明IL1RA能明顯的通過減少IL-1β、IL-8及TNF-α分泌，進而抑制PTOA大鼠軟骨損傷。

軟骨主要由軟骨細胞及細胞外基質組成，后者主要由膠原蛋白及Aggrecan組成。其中COL-Ⅱ占軟骨膠原蛋白90%以上，維持著軟骨的三維網狀結構，為細胞外基質提供支架及彈性。蛋白多糖含有大量親水性的支鏈，能夠維持著軟骨的潤滑及抗壓作用。當軟骨降解速度遠大于合成速度后，說明軟骨細胞分泌大量的降解酶，如MMPs及ADAMTs。MMPs是一種依賴于Zn2+的蛋白水解酶，其中的膠原酶MMP-1能夠降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ型膠原酶，MMP-13不僅能夠降解軟骨特異性COL-Ⅱ及新生的COL-Ⅱ，還能夠激活其他MMPs，發揮其對膠原的降解作用。ADAMTs是一種新型的金屬蛋白酶，對Aggrecan具有明顯的降解作用。目前研究最多的ADAMTs為ADAMTs-4及ADAMTs-5，二者在軟骨、心臟、腦等多種組織器官中有表達，并有多個Aggrecan水解酶位點，同時受IL-1等炎癥因子的影響。另外細胞外基質的降解速度大于合成速度，也源自于TIMPs分泌量的減少。TIMPs不僅能夠與1∶1的比例與MMPs特異性結合，還是ADAMTs內源性的抑制劑。其中TIMP-1能與MMP-1及MMP-13結合抑制二者的表達，TIMP-3能與ADAMTs-4及ADAMTs-5結合抑制二者的表達。研究顯示ADAMTs-4及ADAMTs-5基因敲除的小鼠OA能得到明顯改善，而且體外通過IL-1β誘導軟骨細胞后并敲除ADAMTs-4及ADAMTs-5表達，能明顯的抑制Aggrecan的降解[13]。TIMP-1及TIMP-3在OA體外或體內模型中表達量均明顯降低[14-15]。因此通過上調TIMP-1及TIMP-3表達，進而抑制MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4及ADAMTs-5表達，能明顯抑制COL-Ⅱ及Aggrecan含量的減少，進而降低軟骨細胞外基質的降解速度。所以本研究進一步探討IL1RA對PTOA大鼠軟骨組織中膠原蛋白、Aggrecan、細胞外基質合成與降解蛋白表達的影響，結果表明IL1RA能明顯上調COL-Ⅱ mRNA、Aggrecan mRNA、TIMP-1蛋白、TIMP-3蛋白表達，下調MMP-1、MMP-13、ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA及蛋白表達，進而維持軟骨基本結構。

綜上所述，IL1RA能夠通過促進軟骨細胞外基質合成，抑制基質降解，進而抑制PTOA大鼠軟骨損傷。