香葉醇聯合對丙基苯甲醛抑制肝癌HepG2細胞增殖作用及機制研究

付薛艷，黃羽靜，王 玲，楊 揚，2△

(1.桂林醫學院藥學院，廣西桂林 541000； 2.廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室，廣西桂林 541004)

肝癌是第五大常見的癌癥，病死率排名全球第三。目前，治療早期肝癌的首選方法是手術切除，術后生存率較高，但是許多肝癌患者在確診時已是晚期，錯過了最佳治療時機，只能依賴化療或放療等治療方式[1]。化療和放療都是有著高副作用的方法，對身體損害很大。因此，開發高效、低毒的抗肝癌藥物仍是目前的一個研究焦點。長期以來，中草藥具有毒副作用小、價格低廉等優點，用于腫瘤的治療越來越受到國內外學者的關注和認可[2]。

草果為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果的干燥果實，分布于中國云南、廣西、貴州等地，具有燥濕除寒、祛痰截瘧、健脾開胃、利水消腫的功能。課題組前期研究發現草果揮發油具有體內外抑制肝癌細胞增殖的作用[3-4]，且通過體內外實驗確證了其能夠誘導HepG2 細胞凋亡，但目前對其抗肝癌作用的有效成分及作用方式尚不清楚。因此本課題以HepG2細胞為實驗對象初步研究了其主要成分香葉醇和對丙基苯甲醛的抗肝癌活性及作用方式，為揭示草果揮發油抑制肝癌HepG2細胞增殖抗肝癌的物質基礎和作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料 香葉醇、對丙基苯甲醛均購自美國Sigma-Aldrich公司；人肝癌細胞系HepG2細胞由桂林醫學院藥理實驗室提供；四甲基偶氮唑藍(MTT)粉末、雙抗、胰酶、PBS均購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMSO購自北京索萊寶生物科技有限公司；6孔板、96孔板、培養皿均購自廣州JET-BIOFIL公司；培養瓶購自美國Thermo公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司。

1.2儀器 潔凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；分選型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；CO2恒溫細胞培養箱(MCO-15PC日本三洋)；恒溫水浴鍋(金壇恒豐儀器廠)；微量振蕩器(江蘇泰縣醫療器械廠)；離心機(上海安婷科學儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥(重慶銀河試驗儀器有限公司)；血細胞計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；酶聯免疫檢測儀(南寧市精密儀器儀表有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 將肝癌HepG2細胞培養于含10%胎牛血清1%雙抗(即100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素)的DMEM高糖培養液中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的細胞培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗[5]。

1.3.2MTT法 單獨用藥：取對數生長期的HepG2細胞制備成每毫升5×104個的單細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔細胞培養板中，將細胞培養板放在37 ℃、5% CO2培養箱中預培養。待細胞貼壁生長至50%～60%時，吸除舊培養液[6]，每孔單獨加入100 μL含香葉醇(終濃度為90、100、110、120 μg/mL)或對丙基苯甲醛(終濃度為90、110、130、150 μg/mL)的DMEM培養液處理HepG2細胞；用等量的DMSO加入未經藥物處理的細胞作為對照組；不含細胞的DMEM培養液作為空白組。培養24 h后每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄去原培養液，加入100 μL DMSO，于微量振蕩器上振蕩約20 min至結晶溶解均勻[7]；用酶標儀測定培養板在波長490 nm處的光密度值(OD值)，計算抑制率。細胞生長抑制率(%)=[1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)] ×100%[8]。聯合用藥：分別聯合不同濃度的香葉醇(終濃度90、100、110、120 μg/mL)和對丙基苯甲醛(終濃度90、110、130、150 μg/mL)處理HepG2細胞；用等量的DMSO加入未經藥物處理的細胞作為對照組；不含細胞的DMEM培養液作為空白組。根據實驗數據采用金正均法[9]計算兩藥協同作用的指數Q值，Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判斷兩藥相互作用的性質[10]。EA、EB為單獨用藥所得到的抑制率，EAB為聯合用藥所得到的抑制率。當Q為0.85～1.15時，兩藥聯合使用表現為簡單的相加作用；當Q>1.15時，聯合用藥才具有協同作用；當Q<0.85時，聯合用藥表現為拮抗作用。

1.3.3AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測 取對數生長期的HepG2細胞，以2×104個/孔的密度接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養細胞貼壁生長至70%～80%，吸除舊培養液，分別加入含不同濃度香葉醇(終濃度為80、120 μg/mL)、對丙基苯甲醛(終濃度為80、120 μg/mL)及香葉醇聯合對丙基苯甲醛的培養液處理24 h，將培養液吸到15 mL離心管內(含懸浮凋亡壞死細胞)，用冷PBS洗滌貼壁細胞1次，加入0.5 mL的胰酶消化液(不含EDTA)消化6 min，然后加入之前收集的細胞培養液0.5 mL，輕輕吹打均勻，轉移至相應的離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，收集細胞，用1 mL冷 PBS輕輕重懸細胞并計數(細胞數量不少于5×104個)，然后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞,5 μL的Annexin V-FITC混勻，避光，室溫孵育15 min,加入5 μL的PI染色，上機前補加200 μL的1×Binding Buffer，30 min內進行流式細胞檢測。

2 結 果

2.1單獨用藥 90、100、110、120 μg/mL香葉醇單獨作用于HepG2細胞增殖的抑制率分別為(2.33±0.22)%、(3.25±0.08)%、(9.23±0.06)%、(12.00±0.26)%，90、110、130、150 μg/mL對丙基苯甲醛單獨作用于HepG2細胞增殖的抑制率分別為(6.86±0.23)%、(12.86±0.18)%、(14.43±0.30)%、(26.49±0.50)%，香葉醇和對丙基苯甲醛均對HepG2細胞增殖有一定的抑制作用。

2.2聯合用藥 聯合用藥處理HepG2細胞的抑制率較單獨用藥組明顯提高(P<0.05)，均表現出協同作用，見表1、2。

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率 對肝癌HepG2細胞用不同濃度的香葉醇、對丙基苯甲醛單獨處理和聯合應用處理后，利用AnnexinV-FITC/PI雙標法，經流式細胞儀檢測。香葉醇濃度為80～120 μg/mL時，HepG2細胞凋亡率為7.94%～9.69%；對丙基苯甲醛濃度為80～120 μg/mL時，HepG2細胞凋亡率為5.35%～5.60%；當香葉醇聯合對丙基苯甲醛時，HepG2細胞凋亡率為19.24%～39.48%。與對照組比較，單獨用藥組促進了肝癌HepG2細胞的凋亡，聯合用藥組與單獨用藥組相比促凋亡能力更明顯，見圖1。

表1 不同濃度聯合用藥作用于HepG2細胞的抑制率

表2 不同濃度聯合用藥作用于HepG2細胞的協同作用

A：對照組；B：80 μg/mL香葉醇組；C:80 μg/mL對丙基苯甲醛組;D:120 μg/mL香葉醇組;E:120 μg/mL對丙基苯甲醛組;F:80 μg/mL香葉醇聯合80 μg/mL對丙基苯甲醛組;G:80 μg/mL香葉醇聯合120 μg/mL對丙基苯甲醛組;H:120 μg/mL香葉醇聯合80 μg/mL對丙基苯甲醛組;I:120 μg/mL香葉醇聯合120 μg/mL對丙基苯甲醛組

圖1各組細胞凋亡率

3 討 論

肝癌是一個世界性的健康問題，起病較隱匿，病程較短，病死率高，是當前世界上最常見的惡性腫瘤之一，尤其是在亞洲、非洲和歐洲南部，其發病率位居全球腫瘤疾病的第7位，病死率更是高居第3位[11]。肝癌的致癌過程非常復雜，由病毒、化學致癌物等諸多因素引起的肝細胞生長失控而導致的癌變，經歷啟動-促進-演變等多個階段的發病過程，與多種基因的調控和表達密切相關。目前肝癌的致病機制尚未研究清楚，療效亦不確切。中國是肝癌高發地區，其生存率較低，對生命健康的危害極大[12-14]。長期以來，中醫藥治療肝癌不斷向前發展，其在改善癥狀、減輕痛苦、延緩進程、延長生命期限方面發揮著越來越大的作用，臨床與實驗研究也證實了多種中藥的抗癌作用，為肝癌的治療開辟了新的空間[13]。中醫藥在減輕化療、放療的毒副作用，增強機體抗病能力，提高患者的生存質量方面均有明顯的效果，是治療肝癌的一種非常重要的方法[15-16]。香葉醇和對丙基苯甲醛是草果揮發油中最主要的成分，前期大量研究發現，香葉醇抑制細胞氧化應激，減輕血管內皮炎性反應，從而抗動脈粥樣硬化；調節血膽固醇、三酰甘油代謝紊亂和抗多種腫瘤細胞增殖等作用[15]。但目前苯甲醛類物質的藥理研究比較少見，暫無對丙基苯甲醛抗腫瘤的報道。

本實驗選用草果揮發油中最主要的成分香葉醇及對丙基苯甲醛作為研究對象，通過體外實驗研究其抗肝癌作用及其作用方式。結果顯示，香葉醇和對丙基苯甲醛單用對HepG2細胞增殖均有一定的抑制作用，但不明顯。兩種藥物聯合對HepG2細胞增殖的抑制作用明顯優于單獨用藥，說明二者的作用方式很可能不是單獨作用，而是通過協同來達到抑制的效果。同時證明這種協同作用是通過誘導細胞凋亡來實現的，這為草果揮發油的進一步應用提供了有效的實驗依據。但本研究僅局限于體外實驗，草果揮發油誘導細胞凋亡具體作用的有效成分還需要進一步開展體內實驗驗證。