華法令和低分子肝素對狼瘡抗凝物檢測的干擾研究

靳 巖，張鳳華，曹盛吉，王筱雨，袁曉陽

(大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科,遼寧大連 116011)

狼瘡抗凝物(LA)是抗磷脂抗體的一種，LA的持續存在常見于抗磷脂綜合征，主要表現為血栓和反復流產[1]，有非常廣泛的產科風險[2]。LA檢測受到多種因素干擾，抗凝藥物是其中之一。本文探討口服華法令和肌肉注射低分子肝素(LMWH)對LA檢測的干擾。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2-9月本院門診及病房心臟機械瓣膜置換術后口服華法令患者80例，其中男48例，女32例，年齡35～83歲，平均(68.8±21.5)歲；腎病透析肌肉注射LMWH患者80例，男43例，女37例，年齡16～85歲，平均(64.5±16.2)歲。

表1 各組LA情況

*：P<0.01，與對照組比較

表2 口服華法令LA比值假陽性患者混合試驗情況

*：P<0.01，△:P>0.05,與對照組比較

排除抗磷脂綜合征、系統性紅斑狼瘡、結蹄組織病等引起LA陽性患者。按國際標準化比值(INR)和LMWH抗Ⅹa活性分組：口服華法令分為INR≤1.5、>1.5～2.0、>2.0～2.5、>2.5，肌肉注射LMWH分為抗Ⅹa活性(IU/mL)≤0.5、>0.5～1.0、>1.0～1.5、>1.5，每組20例。對照組為健康體檢者(問卷調查和化驗結果、體檢報告結果表觀正常)，男13例，女7例，年齡40～68歲，平均(62.6±13.1)歲。本研究經倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2方法 所有研究對象109 mmol/L 枸櫞酸鈉抗凝血2 000 r/min離心15 min，口服華法令患者采用凝固法在cs-5100血凝儀上檢測凝血酶原時間(PT)并換算成INR，肌肉注射LMWH患者采用發色底物法在ACL TOP 700血凝儀上檢測LMWH抗Ⅹa活性。檢測后取出血漿再次離心去除血小板(低于10×109/L)后放入EP管中-40 ℃冰凍保存，待樣本收集完全，37 ℃速溶后統一檢測LA。LA用改良蝰蛇毒磷脂時間(DRVVT)法在CS-5100血凝儀上檢測篩選試驗時間(正常值31～44 s)和確證試驗時間(正常值30～38 s)，結果用比值表示(>1.2為陽性)[3]。試劑及質控品為原廠配套試劑。從口服華法令組LA比值假陽性樣本中隨機選取20例，用健康人混合血漿1∶1稀釋做混合試驗，重新檢測上述指標，混合血漿凝血因子接近100%,血小板計數小于10×109/L。

2 結 果

口服華法令、肌肉注射LMWH各組篩選、確證試驗時間均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，且隨著INR、LMWH抗Ⅹa活性增加，篩選、確證試驗時間值及LA比值、LA比值假陽性率呈上升趨勢，見表1。混合試驗中，口服華法令組篩選、確證試驗時間均高于對照組(P<0.01)，LA比值差異無統計學意義(P>0.05)，LA比值假陽性率均為0，見表2。

3 討 論

2009年國際血栓和止血協會(ISTH)建議對抗磷脂綜合征患者進行LA檢測，推薦DRVVT作為LA檢測首選方法[4]，包括篩選試驗和確證試驗。在LA篩選試驗中，魯賽爾氏蝰蛇毒直接激活Ⅹ因子使血漿凝固。存在LA能使LA1篩選試劑的凝固時間延長，LA2確證試劑和LA1篩選試劑一樣，但含高濃度磷脂，外源性磷脂與LA抗體結合，很大程度上糾正了凝固時間。華法令使維生素K依賴凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成減少，凝血酶原時間延長，從而達到抗凝血作用，世界衛生組織(WHO)要求采用INR統一判斷治療效果。口服華法令患者Ⅹ因子減少是引起LA假陽性的重要原因，華法令導致凝血時間延長與LA導致凝血時間延長疊加增加了LA檢測難度[5]。ISTH 2009 LA診斷指南推薦患者停藥1～2周或INR<1.5時再行檢測[6]，當INR>1.5時用1∶1混合試驗。本研究發現即使INR<1.5，也會有LA比值假陽性，并且會使篩選試驗時間和確證試驗時間延長，與此指南有差異。而英國血液學標準化委員會(BCSH)2012 LA診斷指南[7]刪除了當INR<1.5時直接檢測LA這一項，可能也發現了這個問題，推薦口服華法令做混合試驗和大班蛇毒凝固時間法(TSVT)+蛇靜脈酶時間(ET)檢測LA。TSVT+ET目前國內很難展開，1∶1混合試驗簡單可行，即健康人混合血漿(至少20例)和患者血漿1∶1混合后檢測LA，主要可排除凝血因子缺乏的影響?；旌涎獫{補充了患者缺乏的Ⅹ因子，使凝血時間正常，LA比值正常。能糾正由華法令引起的假陽性，與本試驗結果相吻合。但因為稀釋效應可導致1∶1混合試驗出現假陰性[8]，本試驗口服華法令LA假陽性患者混合試驗的篩選、確證試驗時間較健康者延長(P<0.01)可以證明這一點，盡管篩選、確證試驗時間都在正常范圍內?；旌显囼炾幮圆荒芡耆懦齃A存在。

DRVVT試驗的試劑中存在抗肝素劑，試劑說明書中明確規定當肝素水平達到1 U/UL時，對結果沒有影響，因LA篩選試劑和LA2確證試劑中含中和試劑，可能針對的是小劑量的普通肝素而對LMWH無效，其原因是LMWH主要含抗Ⅹa，LMWH抗Ⅹa活性檢測是專家推薦的監測LMWH抗凝效果的方法[9]。而DRVVT蝰蛇毒直接激活Ⅹ因子，因而使用LMWH會出現LA比值假陽性。有報道接受LMWH治療的患者血漿抗Ⅹa活性能夠被檢出，但水平仍然很低[10]。本研究發現即使血漿中LMWH抗Ⅹa活性不高也能使篩選、確證試驗時間延長，出現LA比值的假陽性。

LA陽性大多伴血栓，而血栓患者大多服抗凝藥物，調查顯示1/3患者在進行LA檢測時已經進行抗凝治療[11]。實驗室與臨床應建立及時有效的溝通程序，減少分析前干擾因素對結果解釋的影響[12]。應在報告陽性結果時審查患者當前治療藥物，間隔12周重新檢測，LA持續陽性與血栓風險更相關。