水酶法提取大豆油工藝中乳狀液的酶法破乳研究

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(1.北部灣大學食品工程學院,廣西欽州 535011; 2.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

水酶法是20世紀興起的一種環境友好的綠色制油技術,它以水為提取介質,利用機械方式和酶破壞油料細胞壁,將油脂釋放出來,再利用油水密度差異,分離油和非油成分[1-2],具有無溶劑殘留、蛋白變性程度低、無污染等優點[3-4],被廣泛應用于多種作物提油工藝中,如大豆[5]、花生[6]、葵花籽[7]、菜籽[8]、玉米[9]、米糠[10]等。在水酶法水解過程中,蛋白質、油、磷脂以及其他一些大分子物質,比如淀粉與纖維素等,同時釋放,這些物質相互結合,將油脂包裹,形成穩定的乳化體系[11],所以酶解離心后直接回收得到的游離油非常有限,大部分油都存在于油、水界面間的乳狀液中,因此破乳對水酶法技術的發展和應用至關重要。目前常用的破乳方法有加熱法[12]、冷凍解凍法[13]、乙醇法[14]、生物酶法[15-16]、超聲聯合酶法[17]、調節pH法[18]。生物酶法是利用酶將乳狀液中包裹在油脂外圍的物質分解,從而達到釋放油脂、回收游離油的目的[6],較于其他破乳方法,生物酶法具有反應時間短、污染小、破乳率高的特點[13,15],但目前對于酶法破乳主要集中于工藝條件的優化[16-17],而對破乳過程中乳狀液相關性質,如乳狀液粘度、電位、油滴粒徑分布等變化的系統研究較少,而這些性質直接影響著乳狀液的穩定性[18]。

本實驗針對乳狀液中的主要組成成分,分別采用α-淀粉酶、纖維素酶、Alcalase堿性蛋白酶、7L中性蛋白酶進行破乳,針對具有良好破乳效果的酶,動態考察其對破乳率及乳狀液性質(粘度、Zeta電位、油滴粒徑分布和平均粒徑)的影響,為酶法破乳機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Alcalase堿性蛋白酶(1.2×105U/mL) 丹麥Novo公司;7L中性蛋白酶(1.5×105U/mL) 杰能生物科技集團;α-淀粉酶(3.7×103U/g) 北京奧博星生物技術有限責任公司;纖維素酶(1.5×104U/g) 美國Sigma公司;大豆 墾農22號,含油率為22.3%,蛋白質量分數為32.7%,貯存于4 ℃的冰箱中。

Master2000型激光粒度儀、ZEM 5003型Zeta電位儀 英國馬爾文公司;RS-150型流變儀 德國哈克公司;Z36HK型高速恒溫離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司;KDN-04Ш型蛋白質測定儀 上海纖檢儀器有限公司;RT5-磁力攪拌器 德國IKA公司;BH-2研究級顯微鏡 日本奧林巴斯株式公社。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取大豆油工藝中所形成乳狀液的制備 乳狀液的制備借鑒李楊等[19]的方法,其主要工藝流程為清理除雜的大豆經粉碎后按含水率14%加水混合進行擠壓膨化,膨化條件為模孔孔徑18 mm,套筒溫度90 ℃,螺桿轉速100 r/min,膨化大豆冷卻后粉碎并過80目篩,按料液比1∶6.5 g/mL加水混合,在pH9.5,55 ℃,2% Alcalase堿性蛋白酶(w/w,酶與豆粉質量比)酶解3 h,所得酶解液升溫至90 ℃加熱10 min滅酶,4500 r/min離心20 min后,離心管中的物質分為四相,從頂部到管底分別為游離油、乳狀液、水解液和不溶性殘渣,將乳狀液從離心管中分離出來,收集的乳狀液放置于4 ℃冰箱24 h,去除沉析出來的水分后,進行下面的實驗研究。

1.2.2 乳狀液中各組分含量的測定 蛋白含量的測定:依據GB 5009.5-2016中凱氏定氮法進行測定;乳狀液中油脂含量的測定:依據GB 5009.6-2016中的堿水解法測定;原料和殘渣中的油脂含量:依據GB 5009.6-2016索氏抽提法進行測定;水分的測定:依據GB/T 14489.1-2008;碳水化合物的測定:依據酸水解法測定[20];纖維素的測定:酸性洗滌劑法[20];磷脂含量的測定:采用GB/T 5537-2008中的重量法。

1.2.3 各種酶破乳方法的比較 將若干裝有15 g乳狀液的小燒杯置于不同溫度的水浴鍋中,分別添加α-淀粉酶、Alcalase堿性蛋白酶、7L中性蛋白酶、纖維素酶,酶與底物比均為0.6×105U/g,在各酶最適溫度及pH條件下酶解1 h后,3000 r/min離心15 min回收乳狀液中的游離油,同時設置各酶解條件下不加酶的空白樣實驗,以破乳率比較破乳效果。各酶的酶解條件如下:

淀粉酶:酶解溫度55 ℃,pH6.5;纖維素酶:酶解溫度37 ℃,pH5;堿性蛋白酶Alcalase:酶解溫度55 ℃,pH9;中性蛋白酶7L:酶解溫度55 ℃,pH7。

破乳率計算公式為:

1.2.4 酶添加量及酶解作用時間對破乳效果的影響 取若干份乳狀液置于55 ℃的水浴鍋中,7L中性和Alcalase堿性蛋白酶添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%(w/w)時,在各自適宜的pH條件下,分別測定酶解10、20、30、60、90、120 min時的破乳率。

當Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶濃度分別為0.5%和1%,酶解時間分別為0.5、1 h時,考察兩種酶對乳狀液粘度、粒徑分布、平均粒徑、電位值的影響。

1.2.5 乳狀液表觀粘度的測定 按Jung等[21]的方法并稍作修改,在室溫條件下,采用流變儀(模具60 mm)在剪切速率0.01～1 000 s-1范圍內測定乳狀液的表觀粘度。

1.2.6 乳狀液中油珠粒徑分布及平均粒徑D4,3值的測定 參照Nikiforidis等[22]的方法,并作修改。將破乳后的乳狀液用去離子水稀釋至11%～14%濃度,室溫下用激光粒徑分析儀測定油珠粒徑分布,其中油滴的折光指數選擇1.47,驅散相折光指數為1.333,同時測定油珠平均粒徑D4,3值。

1.2.7 乳狀液電位的測定 參照Nikiforidis等[22]的方法,并作修改。將破乳后的乳狀液加入去離子水稀釋至0.01%濃度,充分混勻后,所得液體裝入測量皿,放入Zeta電位儀中測其電位。

1.2.8 乳狀液的微觀結構觀察 利用考馬斯亮藍對蛋白質染色,蘇丹紅Ⅲ對脂肪球染色的原理,將少量蘇丹紅Ⅲ和0.2%考馬斯亮藍染液先后加入乳狀液中輕輕晃動混勻,在光鏡下觀察染色后的乳狀液微觀結構。

1.2.9 數據處理 所有試驗數據均為3次平行測定結果,采用Statistix 8.1軟件進行顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 乳狀液的組成

表1顯示乳狀液的主要成分是油和水,而含量較少的蛋白質、淀粉、纖維素和磷脂組成了乳狀液中的連續相,維持著乳狀液的穩定。

表1 乳狀液的主要成分Table 1 Main components of the emulsion

蛋白和磷脂是良好的乳化劑[23-24],可降低乳狀液中油水層間的界面張力,特別蛋白還可在液滴之間形成靜電阻礙,抑制油滴聚集[25]。淀粉和纖維素可與蛋白質結合在一起增加油水界面膜的有效吸附層厚度和界面粘滯力,抑制油滴聚合[24,26]。

Zhang等[23]已證實磷脂在室溫條件下濃度2%時可抑制油珠之間的聚合,由于磷脂在本乳狀液中含量較低,且磷脂酶價格較高,考慮到經濟成本,本實驗不選用磷脂酶破乳,而是針對乳狀液中的淀粉、纖維素、蛋白質,選用α-淀粉酶、纖維素酶、Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶進行破乳。

2.2 各種酶的破乳效果

圖1顯示在所選酶中,破乳率最高的是Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶,然后依次是纖維素酶、α-淀粉酶。由于Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶對蛋白的水解作用,蛋白乳化性能下降,導致實現破乳,這說明蛋白是維持乳狀液穩定的主要物質。值得注意的是,盡管纖維素酶的破乳率較高,但是與其酶解條件下的空白樣相比破乳率并無顯著差異(p>0.05),說明纖維素酶的添加沒有顯著提高破乳率。多項研究結果已經證明，當乳狀液處于較低pH時,特別是pH在蛋白等電點附近時,由于油體間電荷減弱導致蛋白凝集,乳狀液穩定性顯著下降[13,18]。因此纖維素酶破乳的原因主要來自于酶解時較低的pH(酶解時pH為5)。相比于空白樣,盡管淀粉酶破乳效果明顯,但破乳率并不高,僅為67.2%,不能有效回收乳狀液中的游離油。因此選擇Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶進行下面的實驗。

圖1 各酶的破乳率Fig.1 Demulsification rate of the emulsion with the different enzymes treatment注:圖中不同字母代表數值間差異顯著(p<0.05)。

2.3 蛋白酶對破乳率的影響

圖2顯示相比于未添加酶的空白樣,Alcalase堿性蛋白酶的添加極大促進了乳狀液中油的釋放,增加了游離油回收率。且相同酶解時間內,Alcalase酶濃度的增加提高了破乳率,酶添加量越大,破乳率越高。酶解0～10 min內,酶解時間對破乳率影響極大,游離油得率隨酶解時間的增加明顯上升,此后隨酶解時間延長,各酶濃度條件下破乳率增加緩慢。本實驗中Alcalase堿性蛋白酶在0.5%、1%、1.5%、2%濃度時均可實現100%破乳率。

圖2 Alcalase堿性蛋白酶的破乳率Fig.2 Demulsification rate of the emulsion with alcalase protease treatment

圖3顯示添加7L中性蛋白酶同樣可以明顯提高破乳率。相似于Alcalase堿性蛋白酶破乳率的變化規律,酶解0～10 min時,破乳率隨酶解時間延長增加明顯,而酶解10 min后破乳率增加緩慢，酶解60 min后破乳率基本不變。但是,在酶添加濃度和酶解時間相同條件下,7L中性蛋白酶的破乳效果低于Alcalase堿性蛋白酶,這是由于Alcalase堿性蛋白酶對乳狀液中蛋白的水解能力強于7L中性蛋白酶[27],導致對乳狀液穩定性的破壞程度強于7L中性蛋白酶,因此能更有效地將油脂從蛋白膜的包裹中釋放出來。本實驗中7L中性蛋白酶在添加濃度2%,酶解60 min時達到100%破乳。

圖3 7L中性蛋白酶的破乳率Fig.3 Demulsification rate of the emulsion with 7L neutral protease treatment

2.4 乳狀液的粘度

圖4、圖5顯示較與空白樣,Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶極大降低了乳狀液的粘度,且隨酶濃度的增加,水解時間的延長,乳狀液粘度相應降低。由于蛋白酶將油水界面大分子蛋白水解生成小分子的肽,使吸附層不再緊密,導致乳狀液粘度降低[28]。粘度的降低意味著油滴運動所受粘滯阻力的減弱,油滴更易于聚合,因此Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液穩定性下降,破乳率均高于未加酶的空白樣(見結果2.3)。

圖4 Alcalase堿性蛋白酶酶解后的乳狀液表觀粘度Fig.4 Apparent viscosity of emulsion after Alcalase protease treatment

圖5 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液表觀粘度Fig.5 Apparent viscosity of emulsion after 7L neutral protease treatment

相同酶濃度和水解時間內經Alcalase堿性蛋白酶水解后的乳狀液粘度低于7L中性蛋白酶處理的乳狀液,即Alcalase堿性酶降低蛋白粘度的能力強于7L中性酶,這是Alcalase酶破乳率高于7L中性蛋白酶的原因之一。

無論是否添加蛋白酶,乳狀液在剪切速率0.01～100 s-1范圍內,均表現為剪切變稀,呈假塑性流體特性。但當剪切速率大于100 s-1時,乳狀液的粘度不再隨剪切速率的變化而有明顯變化,呈牛頓流體性質。

2.5 乳狀液油珠粒徑分布和平均粒徑

圖6～圖7所示為Alcalase堿性蛋白酶破乳后的油珠粒徑分布與平均粒徑情況,經Alcalase酶處理過的乳狀液油滴發生聚合,油珠粒徑增加顯著(p<0.05)。且隨Alcalase酶濃度和作用時間的增加,粒徑分布曲線相應右移,平均粒徑不斷增大。

圖6 Alcalase堿性蛋白酶酶解后的乳狀液中油珠粒徑分布Fig.6 Particle size distribution profile of the emulsion after Alcalase protease treatment

圖7 Alcalase酶解作用后的乳狀液中油珠平均粒徑Fig.7 Mean droplet diameter of the emulsion after Alcalase protease treatment注:圖中不同字母表示數值間差異顯著(p<0.05)。

由于蛋白酶水解乳狀液中油水界面的蛋白,使蛋白鏈斷裂,界面膜不再緊密,從而使油滴從蛋白的包裹中釋放出來,促進了各油珠間的聚集和合并,導致油珠平均粒徑增大,并且隨酶添加量的增加,酶解時間的延長,油珠平均粒徑增加顯著(p<0.05),最終導致乳狀液穩定性降低,破乳率提高[6]。

與Alcalase堿性蛋白酶相似,添加7L中性蛋白酶的乳狀液,粒徑分布曲線右移,油珠平均粒徑增大,且隨7L蛋白酶濃度和酶解時間的延長,油滴聚集程度增強,平均粒徑增加顯著(p<0.05)(見圖8～圖9)。說明7L中性蛋白酶同樣具有促進乳中油滴聚合,降低乳狀液穩定性的作用。

圖8 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液中油珠粒徑分布Fig.8 Particle size distribution profile of the emulsion after 7L neutral protease treatment

圖9 7L中性蛋白酶酶解后的乳中油珠平均粒徑Fig.9 Mean droplet diameter of the emulsion after 7L neutral protease treatment注:圖中不同字母表示數值間差異顯著(p<0.05),圖10、圖11同。

由于堿性蛋白酶水解蛋白的能力強于中性蛋白酶,因此盡管添加7L中性蛋白酶的乳狀液油珠平均粒徑明顯大于未加酶的空白樣,但在相同水解條件下,經Alcalase堿性蛋白酶處理的乳狀液油珠平均粒徑大于7L中性蛋白酶處理過的乳狀液,這與其破乳率變化趨勢一致。

2.6 乳狀液的電位

大豆乳狀液油-水界面兩邊通常存在電荷,具有雙電層與電位降,特別是起乳化作用的蛋白能夠解離,從而使界面電位更加明顯[29]。表面電位絕對值越大,各油體粒子間的排斥力越大,油體間越不易聚合,乳狀液越穩定;表面電位絕對值越小,各油體粒子間排斥力越小,乳狀液越不穩定。

添加Alcalase堿性蛋白酶或7L中性蛋白酶均可使乳狀液的電位下降(見圖10、圖11)。由于乳狀液中油水界面蛋白被酶水解,引起蛋白分子表面所帶電荷的變化,最終引起乳狀液電位值發生改變。無論Alcalase堿性酶還是7L中性蛋白酶處理的乳狀液,其電位均隨酶濃度的增加而降低;但在相同酶濃度下,隨酶解時間的延長,電位值變化差異不顯著(p>0.05)。

圖10 Alcalase酶作用后的乳狀液電位Fig.10 Zeta potential of the emulsion after alcalase treatment

圖11 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液電位Fig.11 Zeta potential of the emulsion after 7L neutral protease treatment

可見，Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶均能使乳狀液電位下降,油滴間靜電排斥力的減弱有益于油滴發生聚合,乳狀液穩定性下降。

2.7 乳狀液的光鏡圖片

圖12a顯示，破乳前的乳狀液中油滴較小,且數量較多;酶解1 h時,相較于破乳前和未加酶的空白樣(圖b～圖c),添加Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶的乳狀液中油滴數量減少,油珠粒徑明顯增大(圖d～圖e),說明Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶的酶解有效促進了乳中油滴聚合,降低了乳狀液的穩定性。

圖12 乳狀液光鏡照片Fig.12 Photo of the cream from enzyme-assistant aqueous extraction of soy oil注:P為包裹在油滴外圍的蛋白質;O為油滴;(a)破乳前的乳狀液40×;(b)空白樣pH9-55 ℃-1 h 40×; (c)空白樣pH7-55 ℃-1 h 40×;(d)0.5% Alcalse堿性蛋白酶酶解1 h 40×;(e)0.5% 7L中性蛋白酶解1 h 40×。

3 結論

實驗結果顯示,Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶破乳效果優于α-淀粉酶和纖維素酶。相同酶解條件下,Alcalase堿性蛋白酶的破乳率高于7L中性蛋白酶,Alcalase堿性蛋白酶在0.5%、1%、1.5%、2%濃度時,7L中性蛋白酶濃度在2%時均可實現徹底破乳。Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶破乳過程中降低了乳狀液的粘度和電位,導致油滴發生聚集,從而使乳狀液穩定性下降,破乳率上升。