SVF-gel促進糖尿病鼠創面愈合的初步實驗研究

蒯權 王宜梅 李聰 黃娜 祝愿 文輝才

慢性創面多發于糖尿病足、靜脈性潰瘍、褥瘡及深度創傷等疾病[1]，目前臨床上仍缺乏有效的治療方法，其修復難點在于新生血管較正常創面少、創面局部血液供應不足、炎癥因素持續存在等[2]。血管基質組分（Stromal vascular fraction，SVF）是脂肪來源干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）與其他細胞成分相混雜的細胞群體。有研究表明，SVF/ADSCs不僅具有自我更新和分化為各系組織細胞的能力，還可旁分泌多種促進血管新生的生長因子，較其他成體干細胞更易獲取，儲量豐富，較少涉及倫理問題，被廣泛地應用于缺血性疾病的治療[3-5]。但是SVF和ADSCs的制備過程較為復雜，需要特定的設備裝置；培養過程中添加的異種血清及血清中尚未明確的蛋白都可能造成污染。SVF-gel是將脂肪組織中的成熟脂肪細胞最大程度破壞而獲取的富集有脂肪來源干細胞和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的混合物[3-5]。研究證實，局部移植SVF-gel到大鼠缺血性皮瓣中，可上調組織中的VEGF和bFGF的表達，促進皮瓣血管的新生[6]。本實驗擬研究SVF-gel對糖尿病鼠創面愈合的促進作用，為SVF-gel治療慢性創面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

8～9周齡SPF級SD大鼠，體質量200～220 g（南昌大學醫學院動物中心）。

鏈尿佐菌素、Ⅰ型膠原酶、紅細胞裂解液（S igma公司，美國），檸檬酸、檸檬酸鈉（北京化工廠），水合氯醛（上海化工廠），CD34免疫組織化學試劑盒（中杉公司），PBS、胎牛血清、高糖DMEM培養基（Gibco公司，美國）。

離心機（中科中佳科學儀器有限公司），吸脂針Tonnard HarvesterTM（Tulip公司，美國），一次性螺旋口無菌注射器10 m L、無菌二通接頭（BD公司，美國），200目篩網（CORNING公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織的獲取

8周齡左右的SD雄性大鼠，腹腔注射麻醉，在超凈工作臺上，取大鼠雙側腹股溝處的脂肪組織，用含有雙抗的PBS反復沖洗去除血液，剔除脂肪組織中的小血管和結締組織并剪碎。

1.2.2 SVF-gel的制備

參照文獻[7]的方法：將剪碎的脂肪組織以1 200 g離心3 min，棄下層液體部分，得到中間層的脂肪，同時收集上層的油脂備用。將脂肪置入2個內徑為2.4 mm直二通管相連的10 mL螺旋口注射器中，以10 mL/sec的推注速度反復推注2 min，成乳糜狀后過濾除去粗大的結締組織，將0.5 mL的油脂加入乳糜化的脂肪組織中，推注3～5次，再以2 000 g離心3 min，棄去下層液體以及上層大量的油脂，得到中間層凝膠樣的物質即為SVF-gel（圖1）。

圖1 制備的SVF-gel Fig.1 SVF-gel

1.2.3 SVF懸液的制備

收集大鼠腹股溝處的脂肪組織10 m L，加入等體積0.1%Ⅰ型膠原酶消化液混勻，在37℃恒溫搖床中消化1 h后，用200目尼龍網過濾，1 500 g離心5 min，去上清，完全培養基重懸細胞沉淀，加入紅細胞裂解液，室溫下孵育5 min，1 200 g離心3 min后，將細胞沉淀加入生理鹽水混懸并計數[8]。

1.2.4 建立糖尿病大鼠創面模型

將SD雄性大鼠適應性喂養1周后，禁食12 h，單次性腹腔內注射55 mg/K g劑量的STZ（溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.0），48 h后尾靜脈取血，用血糖試紙測大鼠的非空腹血糖值≥13.8 mmol/L，并觀察1周，穩定者為糖尿病大鼠模型[9]。將36只糖尿病鼠腹腔注射麻醉后，在背部兩側分別制作直徑為1.2 cm的圓形皮膚全層創面。隨機分為A組（SVF-gel）組、B組（SVF懸液）、C組（生理鹽水），每組12只大鼠。B組創面周圍注射1 mL的SVF細胞懸液（SVF細胞數約為1×105個），A組創面周圍注射含有相同SVF細胞數的SVF-gel，C組創面周圍注射1 mL生理鹽水。觀察治療后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d創面閉合情況，并于治療后14 d每組取4只大鼠觀察創面組織學變化。

1.3 觀察指標

1.3.1 不同時間三組動物創面愈合大小

每組抽取4只大鼠觀察拍照，每只大鼠2個創面，每組共8個創面用來記錄各觀察時間點創面愈合情況。拍照后以Image Proplus 6.0圖像分析系統測量創面面積，計算創面愈合率。

1.3.2 組織學觀察

治療后14 d，每組4只大鼠，取創面及周圍2 mm組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察創面組織內炎癥細胞浸潤情況、創面內新生血管的形成，以及肉芽組織生長和再上皮化情況。

1.3.3 免疫組織化學染色觀察

同法取材、切片，按CD34免疫組織化學染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下觀察血管形成情況，棕黃色即為陽性染色。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 構建糖尿病大鼠創面模型

STZ腹腔注射1周后，尾靜脈取血，測得所有大鼠的血糖值均大于13.8 mmol/L，且有明顯的多飲、多食、多尿、毛色變黃等癥狀，無大鼠因血糖過高死亡。大鼠背部創面形成后分籠飼養，常規觀察，術后動物無死亡，全部存活。

2.2 大體觀察結果

術后3 d拆去敷料后各組創面無血腫、感染及其他不良反應。注射治療后7 d，各組創面表層都被淡紅或暗紅色的痂皮覆蓋，揭去血痂后，A組創面肉芽組織生長良好，顏色鮮紅，濕潤，觸之易出血；B組創面內也可見肉芽組織生成，未見液體滲出；C組創面肉芽組織生長緩慢，顏色略暗，部分表面尚有滲出。治療10 d后，A組創面面積較另兩組顯著減小，再上皮化明顯，C組創面愈合較緩慢，表面仍有部分血痂及少許滲出。治療14 d后，A組創面幾乎完全愈合，B組創面部分愈合，表面有薄層的上皮覆蓋，C組創面愈合最差，創面面積明顯大于另兩組（圖2）。

圖2 各組創面在不同時間點愈合情況Fig.2 Wound healing at different time points in each group

2.3 創面愈合率比較

A、B組各時間點創面愈合率均優于C組（P＜0.05），且A組各時間點創面愈合率均優于B組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組不同時間點創面愈合率比較Table 1 Comparison of wound healing rates at different time points in each group

2.4 組織學觀察

HE染色見C組創面內有大量炎癥細胞浸潤和成纖維細胞，細胞排列紊亂，新生血管少，肉芽組織結構疏松，再上皮化不完整。A組與C組相比，炎癥細胞浸潤減少，真皮毛細血管數量明顯增多，再上皮化明顯，肉芽組織結構致密。B組與C組相比，炎癥細胞浸潤減少，較多的膠原纖維及毛細血管，再上皮化較完整，但不及A組（圖3）。

圖3 治療后14 d各組組織形態學觀察（200×）Fig.3 Histological observation of each group by HE staining 14 days after treatment(200×)

2.5 免疫組織化學染色觀察

各組創面肉芽組織內均有垂直于創面的新血管生成。A、B兩組新生血管數量多于C組，C組部分新生血管尚無明顯的管腔結構，血管斷層僅有單個內皮細胞。A、B組創面內均可見較多具有成熟管腔的新生血管，尤以A組為多（圖4）。

圖4 治療后14 d各組免疫組化觀察血管形成情況（200×）Fig.4 The angiogenesis in each group detected by immunohistochemical staining 14 days after treatment(200×)

3 討論

創面組織的愈合是通過一個及時有序的連續過程來恢復組織功能與解剖的完整性。當創面受到內外因素的影響，這種有序的過程會受到干擾，使創面停滯在病理炎癥反應狀態，導致創面遷延不愈[10]。血管再生是創面修復的重要環節，血管新生速度減慢或者功能降低都有可能導致局部血液循環不良，周圍組織缺血缺氧。這樣不僅會損害人體抵抗細菌的防御系統，使創面易感性增加，也會影響機體的新陳代謝能力，使創面內的膠原蛋白合成減少，血管內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞等的增殖遷移受到限制[11]。

治療慢性創面的方法主要包括外科治療（清創、植皮、皮瓣移植等）、高壓氧治療、外源性生長因子的應用、負壓引流術和光子治療等，療效各異[12]。目前，干細胞療法被認為是最具前景，最早應用于慢性創面治療的是BMSC[13-15]，但抽取骨髓是高度侵入性的，且數量稀少[16]。與此相比，ADSC獲取容易，且含量遠高于BMSC，更有研究證實ADSC增殖分化能力強于BMSC[17-18]。因此，ADSC可作為一種更加優質的細胞資源用于慢性創面的治療。大量報道認為，新鮮分離的SVF細胞和培養后的ADSC用于治療糖尿病或難愈性潰瘍，其促愈合機制不僅是直接分化為像血管內皮細胞、成纖維細胞和表皮細胞等各種修復細胞，而且還可旁分泌出多種生物活性分子，如VEGF、HGF、FGF等來促進血管生成和創面再上皮化，減少炎癥和細胞凋亡，參與創面的損傷修復，實現創面加速愈合過程[19-22]。

SVF-gel是將脂肪組織經簡單的機械方法處理而獲取的凝膠狀物質，含有高度濃縮的具有生物活性的ECM和SVF。本實驗中，我們局部注射SVFgel到糖尿病鼠創面中，發現治療后大鼠創面愈合率在各個時間點都高于另兩組，組織學結果也證實SVF-gel可明顯減輕創面局部炎癥反應，增加血管網的數量，促進肉芽組織生長，加速再上皮化的形成。與SVF懸液相比，雖然兩者的SVF細胞數相同，但SVF-gel顯示出更佳的治療效果。這主要是SVFgel中的ECM發揮著天然細胞載體的作用。研究表明，如直接將ADSC注射到病變部位，微環境中缺血缺氧和炎癥反應、注射過程中的機械性損傷，以及經過組織間隙的大量流失，均可導致其在靶區域存活率下降，使之發揮的作用有限[23-24]。而ECM包含了纖維蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖，可以為ADSC提供良好的微環境，調節細胞的行為，促進細胞的增殖和分化潛能，讓ADSC能分泌更多的血管生長因子，保護其免遭巨噬細胞的吞噬，使之能在創面處充分地發揮促愈合的能力[25-26]。

SVF-gel治療機制尚不清楚，還有待于進一步的研究。