赪桐根4個極性部位抗炎活性的比較

唐云麗， 劉君君， 潘翠柳， 秦祖杰， 丘 琴， 歐和生

（廣西中醫藥大學中藥藥理學重點實驗室，廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院，廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西南寧530020）

赪桐根為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum（Thunb.）Sweet的根，又名紅苓蔃、荷苞花、百日紅［1］、 棵朋必勞［2］、 “個朋被”［3］（廣西壯族語）， 為廣西常用壯藥［4-5］，其味甘，性涼，具清肺熱、利小便、涼血止血功效，主治肺熱咳嗽、熱淋小便不利、咳血、風濕骨痛［6］等。

炎癥是多種疾病的共同過程，其發生發展與骨質疏松［7］、 糖 尿 病［8］、 心 血 管 系 統 疾 病［9］、 阿 爾 茨 海 默病［10-11］、 癲癇［12］、 癌癥密切相關［13-14］， 而一些具有良好抗炎作用的中草藥 （民族藥）可能通過調節炎癥相關因子來對這些疾病產生較好的預防和治療作用。赪桐根為廣西常用民族藥，以其為君藥組成的赪銀合劑對風熱型急性扁桃體炎有較好療效［15］，課題組前期研究證明，其水提物對急、慢性炎癥均具有明顯作用［16］，并且其醇提物也具有相應活性，但具體部位及機制目前尚不明確。因此，本實驗比較赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位抗炎活性，以期篩選出有效部位，進一步明確活性成分，闡明其可能作用機制，為該藥材深度開發和臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材 赪桐根采自武鳴區高峰林場，經廣西中醫藥大學滕建北副教授鑒定為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum （Thunb.） Sweet的根。

1.2 試藥 醋酸地塞米松 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號150116，0.75 mg）；頭孢克肟分散片 （浙江莎普愛思藥業股份有限公司，批號160151E，50 mg）。二甲苯 （批號 F20110613，500 mL）、冰醋酸 （批號 T20110913，500 mL）、伊文思藍 （批號Lot.No.20140723，10 g） （國藥集團化學試劑有限公司）；角叉菜膠 （上海源葉生物科技有限公司，批號YY13755，100 g）；水合氯醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號2016020101，250 g）。

1.3 儀器 SQP電子天平 ［賽多利斯科學儀器 （北京）有限公司］；UV-1780紫外可見分光光度計 ［島津儀器（蘇州）有限公司］；TGL-16G離心機 （上海安亭科學儀器廠）；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器 （上海迅博實業有限公司醫療設備廠）；BP211D光柵型多功能酶標儀 （瑞士Tecan公司）；LRH-250-S恒溫恒濕培養箱 （韶關市泰宏醫療器械有限公司）。

1.4 動物 清潔級昆明種小鼠，雄性，體質量18～22 g；清潔級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（桂）2014-0002，實驗前適應性飼養3 d。

2 方法

2.1 極性部位制備 取赪桐根粗粉3 kg，加75%乙醇回流提取3次，分別提取2、1.5、1 h，溶劑用量分別為10、8、6倍，過濾，合并濾液，減壓濃縮后置水浴鍋上揮干溶劑，稱定質量，計算得膏率。總浸膏用75%乙醇溶解后，硅膠按1∶1比例拌樣，置于回流裝置中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇回流提取，回收溶劑，減壓濃縮后分別得到石油醚部位19.6 g、乙酸乙酯部位31.7 g、正丁醇部位115.5 g、95%乙醇部位391.5 g，各部位浸膏用0.2%吐溫80溶解，分別配制成高、中、低質量濃度溶液。

2.2 活性部位篩選及抗炎作用研究

2.2.1 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響［16-17］取小鼠196只，按體質量隨機分為模型組、陽性對照組 （地塞米松0.005 g／kg）及赪桐根各極性部位高、中、低劑量組（40、20、10 g／kg）， 每組 14只。 灌胃給藥， 給藥量 20 mL／kg，1次／d，連續7 d，模型組灌胃等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于右后足趾部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.02 mL致炎，15 min后脫頸椎處死，剪取后雙足等同部位，稱定質量，以同一小鼠左右后足質量之差為腫脹度，計算腫脹抑制率［18］。

2.2.2 對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響［16，19］小鼠按 “2.2.1” 項下方法分組給藥， 末次給藥1 h后，小鼠尾靜脈注射0.3%伊文思藍溶液 （10 mL／kg），同時腹腔注射0.6%冰醋酸溶液 （10 mL／kg），15 min后脫頸椎處死，腹腔注射6 mL生理鹽水沖洗腹腔，剪開腹腔收集腹腔液，3 000 r／min離心10 min，取上清液，于590 nm波長處測定吸光度。

2.2.3 對小鼠棉球肉芽腫的影響 取小鼠196只，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，無菌條件下在兩前肢中間的胸部用彎剪剪毛，75%酒精消毒皮膚，手術剪剪出皮下一小口，用鑷子從胸口皮下將棉球 （每粒10 mg，高壓滅菌）分別植入小鼠兩側腋下，縫合傷口并用碘伏消毒。術后第2天，小鼠按 “2.2.1”項下方法分組給藥，末次給藥1 h后脫頸椎處死，剪開皮毛，取出棉球及周圍結締組織，剔去脂肪組織，稱定質量，減去原棉球質量后即為肉芽腫濕重，60℃下烘干至恒重，減去原棉球質量后即為肉芽腫干重。

2.3 石油醚部位抗炎作用研究

2.3.1 二甲苯致摘除雙側腎上腺小鼠耳腫脹［20］取小鼠100只，術前1 d以頭孢克肟灌胃給藥，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，在胸腰椎交界處沿背部正中線、背肋后緣作約0.5 cm長的皮膚、肌肉切口，輕輕摘除腺體和另一側腎上腺，棉球稍止血后縫合肌肉和皮膚，涂以碘伏，術后第2天以頭孢克肟灌胃給藥，再連續3 d給予5%葡萄糖生理鹽水溶液代替蒸餾水飼養。然后，小鼠隨機分為模型組、陽性組及石油醚部位高、中、低劑量組，按“2.2.1”項下方法分組給藥，末次給藥1 h后，于右耳正反兩面各涂二甲苯10 μL致炎，15 min后處死，沿耳根部剪下兩耳，6 mm打孔器在兩耳相同部位等面積打下圓耳片，稱定質量，計算腫脹度和腫脹抑制率，公式分別為腫脹度＝右耳質量－左耳質量、腫脹抑制率＝［（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）／模型組腫脹度］×100%。

2.3.2 角叉菜膠致摘除雙側腎上腺小鼠足跖腫脹［21-22］取小鼠60只，按 “2.3.1”項下方法摘除雙側腎上腺，按“2.2.1”項下方法分組給藥，隨后剪碎右足，4 mL生理鹽水浸泡［13］， 勻漿后 3 000 r／min離心 10 min， 上清液于－20℃下保存，參照試劑盒操作步驟，采用ELISA法測定SOD活性和MDA、NO水平。

2.3.3 對佐劑性關節炎大鼠的影響［23］大鼠隨機分為空白組、模型組、地塞米松組 （0.00 5 g／kg）及石油醚部位高、中、低劑量組，按 “2.2.1”項下方法給藥，每天1次，連續7 d，空白組、模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于大鼠右足皮下注射0.1 ml弗氏完全佐劑，6 h后麻醉大鼠，腹主動脈取血，37℃下水浴1 h后，4℃、3 000 r／min離心20 min，取血清分裝，－20℃下保存，參照試劑盒操作步驟，采用ELISA法測定TNF-α、PGE2、IL-1β、 IL-6、 LTB4水平。

2.4 統計學分析 通過SPSS 19.0軟件進行處理，數據均以 （±s）表示，均值比較采用單因素方差分析，假定方差齊性采用LSD法，未假定方差齊性采用Dunnett’s T3法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 赪桐根活性部位篩選及抗炎作用研究

3.1.1 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響 圖1顯示，與模型組比較，除乙酸乙酯部位低劑量組外，各極性部位組對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹均有顯著抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝12～14）

3.1.2 對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響圖2顯示，與模型組比較，除石油醚部位低劑量組外，各極性部位組均能顯著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加 （P＜0.01）。

圖2 對冰醋酸致小鼠毛細血管通透性增加的影響 （±s，n＝12～14）

3.1.3 對小鼠棉球肉芽腫的影響 圖3顯示，與模型組比較，各極性部位組對小鼠棉球肉芽腫均有顯著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）。

3.2 石油醚部位抗炎作用

3.2.1 對摘除雙側腎上腺小鼠的影響

3.2.1.1 二甲苯致耳腫脹 圖4顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著抑制二甲苯致耳腫脹 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.2.1.2 對角叉菜膠致足跖腫脹的影響 圖5顯示，與模型組比較，石油醚部位高劑量組顯著抑制角叉菜膠致足腫脹 （P＜0.01）。

3.2.2 對MDA、NO水平和SOD活性的影響 圖6～8顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著降低MDA、NO水平 （P＜0.05， P＜0.01）， 升高 SOD 活性 （P＜0.01）。

圖3 對小鼠棉球肉芽腫的影響 （±s， n＝12～14）

圖4 對二甲苯致耳腫脹小鼠的影響 （±s， n＝10～13）

圖5 對角叉菜膠致足跖腫脹小鼠的影響（±s， n＝10～13）

3.2.3 對佐劑性關節炎大鼠的影響 圖9～13顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著降低TNF-α、PGE2、IL-1β、IL-6、 LTB4水平 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 討論

赪桐根為廣西常用壯藥，具有清肺熱、涼血止血功效，主治肺熱咳嗽、咳血、風濕骨痛等［6］，主要含有鞣質、有機酸、皂苷、黃酮類、酚類、植物甾醇、三萜類、揮發油等成分［24］， 其中鞣質［25］、 植物甾醇［26］、 黃酮類［27］、 皂苷［28-29］等具有良好的抗炎作用。臨床研究證實，赪銀合劑對風熱型急性扁桃體炎有較好療效［15］，赪桐根是其主要君藥；陳俊等［16］發現，赪桐根水提物對急、慢性炎癥均具有明顯作用。

圖6 對MDA水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖7 對SOD活性的影響 （±s， n＝8～10）

圖8 對NO水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖9 對TNF-α水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖10 對PGE2水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖11 對IL-1β水平的影響 （±s， n＝8～10）

炎癥反應是許多不同類型疾病 （如生物性、化學性及物理性疾病）的共同病理過程，也是機體最基本的抗損傷反應，以紅、腫、熱、痛為主要臨床特征，是致炎因子刺激具有血管系統的活體組織對局部損傷的反應，可分為早、中、晚三期，其中在急性炎癥或炎癥早期，以血管壁通透性增強、白細胞和蛋白質造成組織腫脹為特征；在慢性炎癥或炎癥后期，以纖維組織增生、肉芽腫形成為特點［20］。本實驗發現，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位均具有非常明顯的抗炎效果，以石油醚部位最強，乙酸乙酯部位次之；通過冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加、角叉菜膠致小鼠足跖腫脹實驗發現，4個部位具有很強的抑制小鼠足腫脹、明顯改善炎癥早期的通透性增加作用；通過小鼠棉球肉芽腫實驗發現，它們對炎癥后期也具有顯著的抑制作用，可改善腫脹；通過去腎上腺小鼠模型實驗發現，石油醚高劑量組有抗炎活性，但有所減弱，推測可能不完全依賴于下丘腦-垂體-腎上腺軸 （HPAA）系統，而是部分依賴機體內源性抗炎系統；通過檢測去腎上腺小鼠足腫脹部位炎癥因子水平發現，去腎上腺后赪桐根石油醚部位可提高小鼠SOD活性，降低MDA、NO水平，從而發揮抗炎作用。

圖12 對IL-6水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖13 對LTB4水平的影響 （±s， n＝8～10）

超氧化物歧化酶 （SOD）是生物體內重要的抗氧化酶，具有特殊生理活性，也是生物體內清除自由基的首要物質；丙二醛 （MDA）是自由基引發的脂質過氧化反應的一種產物，可激活環氧化酶 （COX），一方面促進花生四烯酸產生前列腺素 （PG），導致細胞代謝紊亂形成炎癥，而另一方面可影響白三烯代謝形成炎癥［16，24，30-31］； 一氧化氮（NO）是一種重要的炎癥介質，能誘導促炎癥因子產生，如腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、 白介素-1β （IL-1β） 等。TNF-α、IL-1β、IL-6等均為重要炎癥介質，是多種信號通路的關鍵因素，其中TNF-α是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞分泌，作為主要的促炎細胞因子，它可與多種類型組織因子和基質蛋白相互作用，使RA關節滑膜細胞增殖，誘導刺激滑膜細胞產生炎癥因子、蛋白激酶、前列腺素E（PGE），直接損害組織；IL-1β是對骨吸收和軟骨破壞的關鍵因子；IL-6是由T細胞、單核細胞、巨噬細胞、滑液成纖維細胞產生的多效炎性細胞因子，參與多種生物過程，如T細胞活化、急性期應答誘導、滑液成纖維細胞增殖［32］。另外，前列腺素E2（PGE2）、白三烯B4（LTB4）為花生四烯酸代謝途徑產生的2個重要炎癥遞質，前者可增加血管通透性，而后者可引起白細胞趨化、聚集、脫顆粒，產生超氧陰離子，從而加重炎癥反應。

綜上所述，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位具有良好的抗炎作用，以石油醚部位最強，并依賴于HPAA軸內部抗炎系統，其抗炎機制可能與減少MDA、 NO、 TNF-α、 PGE2、 IL-1β、 IL-6、 LTB4 等炎癥因子生品、提高SOD活性有關，具體活性成分及其作用機制有待進一步研究。