UPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定半枝蓮-白花蛇舌草藥對(duì)中3種成分

賴昌威， 張 蜀，2?， 鄧 紅，2， 吳國(guó)衛(wèi)， 閔 杰， 阮沛樺

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510000；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510000）

半枝蓮為唇形科黃芩屬多年生草本植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，有清熱解毒、化瘀利尿等功效；白花蛇舌草為茜草科耳草屬一年生草本植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.的干燥全草，有清熱解毒、活血止痛等功效，兩者合用可發(fā)揮協(xié)同增效、配伍減毒之作用，臨床上常作為藥對(duì)用于治療癌癥，市場(chǎng)上將近20個(gè)中藥復(fù)方制劑同時(shí)含有兩者，如天芝草膠囊、抗癌平丸等［1］。黃酮類為半枝蓮、白花蛇舌草的共同活性成分，有抗腫瘤、消炎、抑菌、抗氧化等藥理活性，以抗腫瘤作用更突出［2-3］，故總黃酮含有量是該藥對(duì)質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，而且半枝蓮中的野黃芩苷、白花蛇舌草中的蘆丁藥理活性明確［4-5］、含有量較高［6-7］，也可作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

目前，比色法廣泛應(yīng)用于中藥材與成方制劑中總黃酮含有量的測(cè)定［8］，半枝蓮-白花蛇舌草藥對(duì)提取液中其測(cè)定也沿用此法［9-12］，雖然它應(yīng)用便捷、成本低廉，但并非完全適用，尤其是成方制劑中成分復(fù)雜，黃酮類型不一，難以滿足相關(guān)專屬性要求，可能會(huì)出現(xiàn)黃酮類成分的假陰性與非黃酮類成分的假陽(yáng)性現(xiàn)象［13-14］。本實(shí)驗(yàn)建立UPLCPDA法同時(shí)測(cè)定半枝蓮-白花蛇舌草藥對(duì)中蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量，以期為該藥對(duì)質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器 （美國(guó)Waters公司）；電子分析天平 （千分之一、十萬(wàn)分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗儀 （上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 半枝蓮購(gòu)自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，白花蛇舌草購(gòu)自廣州清平中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定均為正品。蘆丁 （批號(hào)110842-201709，含有量97.5%）、野黃芩苷 （批號(hào)100416-201607，含有量91.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.5%甲酸（B）， 梯度洗脫 （0～2 min， 10%A； 2～3 min， 10%→17%A；3～9 min， 17%A； 9～12 min， 17% →20%A； 12～20 min，20%→27%A； 20～25 min， 27%→42%A； 25～26 min， 42%→10%A）；體積流量0.3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)354 nm （蘆丁）、333 nm （野黃芩苷）；柱溫30℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁、野黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含兩者9.80、186 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取2種藥材適量，按1∶1質(zhì)量比例混合后粉碎 （過(guò)40目篩），精密稱取2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，繼續(xù)加入50 mL 60%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲 （53 Hz）45 min，放冷，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，每1 mL溶液中含兩者各20 mg。

2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，二極管陣列檢測(cè)器對(duì)全部色譜峰進(jìn)行掃描分析 （220～380 nm），其中11個(gè)色譜峰所代表的成分可確定為黃酮類物質(zhì)，結(jié)果見圖1、表1。其中，峰2為蘆丁，峰4為野黃芩苷，見圖2。

表1 各黃酮吸收峰

圖1 各黃酮光譜圖

圖2 對(duì)照品、供試品UPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.6、1.0、 1.4、 1.8、 2.2 μL， 在 “2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液 1 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得蘆丁、野黃芩苷峰面積RSD分別為1.08%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品6份，按 “2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量RSD分別為0.96%、1.49%、1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1 μL，于0、2、4、8、12、16 h在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆丁、野黃芩苷、總黃酮峰面積RSD分別為2.31%、1.04%、1.46%，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的藥材粉末1.0 g，精密加入適量蘆丁 （0.471 2 mg／mL）、野黃芩苷（0.875 0 mg／mL）對(duì)照品，按 “2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）

2.5.6 樣品含有量測(cè)定 取3批樣品，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

3 討論

3.1 黃酮判斷 黃酮有2個(gè)特征吸收帶，分別為桂皮酰系統(tǒng)引起的帶Ⅰ、苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ［15］。白花蛇舌草中黃酮主要為槲皮素與山柰酚的苷元及其糖苷，即黃酮醇類，代表成分蘆丁；半枝蓮中黃酮主要為黃酮類，代表成分野黃芩苷［2-3］，兩者光譜特征見表5。

表5 黃酮光譜特征

3.2 供試品溶液制備方法考察 本實(shí)驗(yàn)先考察超聲、回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果相當(dāng)，故選用操作簡(jiǎn)便的前者。然后，對(duì)提取溶劑 （20%、40%、60%、80%甲醇、純甲醇）、提取時(shí)間 （15、30、45、60 min）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)60%甲醇對(duì)黃酮的親和力最高，同時(shí)提取45 min后蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量不再增加，可認(rèn)為提取完全。最終確定，供試品溶液制備方法為60%甲醇超聲提取45 min。

3.3 總黃酮含有量測(cè)定方法考察 課題組前期采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測(cè)定半枝蓮-白花蛇舌草藥對(duì)總黃酮含有量，發(fā)現(xiàn)兩者均無(wú)法滿足專屬性要求，其中前者僅蘆丁在510 nm波長(zhǎng)處附近出現(xiàn)吸收峰，而藥對(duì)與野黃芩苷在該處均未出現(xiàn) （圖3），另外一些常見黃酮（如山柰酚、黃芩苷、黃芩素、槲皮素等）顯色后在500 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收或僅有弱吸收，但一些非黃酮 （如綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、香草醛等）在該處反而有最大吸收或強(qiáng)吸收［13］；后者專屬性相對(duì)較強(qiáng)，大部分非黃酮對(duì)顯色無(wú)干擾，但少數(shù)黃酮 （如橙皮苷、葛根素、蒙花苷等）在該體系下仍不產(chǎn)生顯色反應(yīng)，而且其結(jié)構(gòu)、極性差異可造成吸收峰偏移，從而影響專屬性［14］，如蘆丁、野黃芩苷分別在420、350 nm波長(zhǎng)處附近出現(xiàn)吸收峰，而藥對(duì)在該處未出現(xiàn) （圖4）。由此可知，比色法測(cè)定總黃酮含有量時(shí)可能會(huì)造成黃酮假陰性與非黃酮假陽(yáng)性問(wèn)題，從而限制了其應(yīng)用。

圖3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法光譜圖

圖4 AlCl3法光譜圖

近年來(lái)，常有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法代替比色法測(cè)定總黃酮含有量，該方法大多通過(guò)總黃酮水解測(cè)定黃酮苷元含有量，再經(jīng)系數(shù)換算后測(cè)得，2015年版 《中國(guó)藥典》一部中銀杏葉總黃酮醇苷含有量測(cè)定也選擇了該方法。本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-PDA法測(cè)定該成分含有量，其中PDA定性時(shí)無(wú)需進(jìn)行水解等繁復(fù)的樣品前處理，更加簡(jiǎn)便快捷；UPLC分析速度快，有利于提高測(cè)定效率，30 min內(nèi)即可完成分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定半枝蓮-白花蛇舌草藥對(duì)中蘆丁、野黃芩苷、總黃酮的含有量，其準(zhǔn)確快速，專屬性強(qiáng)，可為該藥對(duì)質(zhì)量控制提供依據(jù)，也能應(yīng)用于其他成方制劑、中藥材中總黃酮含有量的測(cè)定。